【新技能】Omega引物提升特异性超过26,000倍，你想到了吗？

由于形似Ω，我们称它为OmegaPrimer。Omega primer是由3个功能区段组成：3p臂( 3p arm)是聚合酶延伸反应的启动子；5p臂(5p arm)是结合DNA模板序列的锚；分隔两臂的环（loop）。这么“怪”的引物有什么与众不同吗？因为这样的设计从根本上优于传统的引物，不信，你往下看……

图1 具有3个功能区的新型引物——OmegaPrimer™

你见过上图这样的引物吗？

由于形似Ω，我们称它为OmegaPrimer™。Omega primer是由3个功能区段组成：

• 3p臂( 3p arm)是聚合酶延伸反应的启动子。
• 5p臂(5p arm)是结合DNA模板序列的锚。
• 分隔两臂的环（loop）。这个环是做什么用的呢？

这么“怪”的引物有什么与众不同吗？

因为这样的设计从根本上优于传统的引物，不信，你往下看：

• 大幅提升特异性——omega primer需要3p臂和5p臂同时特异结合模板（template DNA）。这种要求，相比于传统引物，会显著增加引物的特异性（见图2）。
• 具有宽容模板变异的能力——在某些应用中，可有目的地将5p臂设计的较长，以便它能杂交相应的模板，即使该模板中存在一个错配（例如，1个SNP）。这是一个非常有用的特性并具有实际的应用价值。如果考虑到，在拥有30亿个碱基对的人类基因组中有600万个高等位基因频率（> 1%）的SNPs，平均每50 bp就有1个SNP，你就会懂的。
• 大幅降低引物二聚体——可扩增的引物二聚体只在这种情况下产生：当两个引物的3p臂相互杂交，并且至少一个引物的3’末端互补结合到另一个引物上。omega primers通常具有比常规引物（35 nt）更短的3p臂（16 nt），因而在统计学上形成可扩增的引物二聚体的概率要小的多。
• 扩增子中容纳更长的真实序列——1个扩增子的测序读段是由真实序列和引物序列两部分组成。引物的3p臂会纳入扩增子成为引物区段的一部分。由于omega primers具有比常规引物更短的3p臂，因而，由omega primers生成的扩增子中真实序列区段会占有更高的比例。

OmegaPrimer™提升特异性超过26,000倍！

 
图2 OmegaPrimer™具有显著提高的特异性

Omega primer是设计为与相应的模板杂交，形成稳定的环状结构。在上图中，当3p臂与模板间存在错配时，会动摇环状结构的稳定性，导致3p臂从模板上分离，并降低聚合酶延伸引物的概率。形象的说，环结构像是个弹簧，当3p臂与模板链出现个别碱基错配时，这个弹簧就会把3p臂弹开，聚合酶延伸反应也就无法正常进行。此外，由于3p臂较短，其自身并不具有足够的结合模板的能力，也无法支持有效的聚合酶延伸反应。根据概率模型计算，这样的设计使引物特异性提升超过26,000倍。

那么问题来了，OmegaPrimer™是用来做什么的呢？

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下一期会揭晓正确答案。