细胞外RNA提取试剂盒究竟哪家强?[选购宝典]

【字体: 时间:2015年07月13日 来源:生物通

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  商品化的试剂盒能简化和加速exRNA提取过程,已成为循环exRNA研究不可缺少的工具。然而,这些试剂盒的提取效率如何,是否能去除血浆中的污染物,是否会偏向特定的RNA,都没有经过评估,而这类评估对于结果解释和实验之间的比较都很关键。

细胞外RNA(exRNA)已成为研究界的新宠。近年来,人们在血浆或血清样本中成功检测到疾病相关的exRNA,使其有望成为非侵入性的生物标志物。然而,从血浆或血清中分离exRNA仍颇具挑战性,这一方面是因为exRNA丰度低,另一方面是因为血液中的污染物会抑制PCR。

商品化的试剂盒能简化和加速exRNA提取过程,已成为循环exRNA研究不可缺少的工具。然而,这些试剂盒的提取效率如何,是否能去除血浆中的污染物,是否会偏向特定的RNA,都没有经过评估,而这类评估对于结果解释和实验之间的比较都很关键。

于是,美国爱因斯坦医学院的研究人员评估了市场上7种常用的exRNA提取试剂盒,分别来自贝克曼•库尔特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他们具体评估了合成RNA的总体回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA产量和纯度,以及纯化后的扩增效率。研究结果发表在《BioTechniques》7月刊上。

(图片来自原文)

在评估总体回收率和大小偏向时,研究人员使用了6种合成的RNA,其长度在200-6000 nt。他们发现,所有试剂盒的回收率都在50%以上。其中,Zymo的两款试剂盒回收率最高,在80%以上。大部分试剂盒都很好地回收了所有长度的RNA,不过miRCURY-Biofluids试剂盒在4000-6000 nt RNA上有明显的损失。这与试剂盒分离<1000 nt RNA的说明一致。

为了比较试剂盒在血浆exRNA纯化上的表现,研究人员利用每个试剂盒进行三次重复提取,之后利用Qubit定量。结果显示,miRCURY-Biofluids、Quick-RNA以及mirVana试剂盒的每毫升血浆的exRNA产量都在30-40 ng,DirectZol和miRNeasy试剂盒在10 ng左右,而MagMAX试剂盒仅产生了4.1 ng exRNA。此外,RNAdvance试剂盒的产量特别高,这可能是由于裂解液污染。

为了评估从纯化的exRNA中扩增RNA的能力,研究人员开展了RT-PCR反应,扩增hsa-miR-16、hsa-miR-150、GAPDH和ACTB。他们发现,利用miRNeasy试剂盒分离出的RNA,很容易扩增出miRNA和mRNA。不过,有些试剂盒在miRNA扩增上表现良好,但却无法扩增mRNA;而有的试剂盒正相反,在mRNA扩增上表现良好。

这项研究表明,尽管这些试剂盒在回收合成RNA上的总体表现不错(回收率≥50%),但一些表现出RNA长度的偏向。血浆的exRNA产量因试剂盒而异,但一些试剂盒可能引入污染。此外,exRNA样品的RT-PCR扩增差异明显,部分原因是样品中存在抑制剂。

最关键的是,大多数试剂盒纯化出的exRNA样品都表现出特定RNA种类的扩增偏向,如Quick-RNA偏向mRNA,而DirectZol偏向miRNA。因此,作者认为,不同试剂盒在不同程度上反映了血浆exRNA的内容,相互之间难以比较。这一发现也有助于解释为何exRNA结果缺乏重复性。(生物通 薄荷)

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原文检索

Comparison of plasma extracellular RNA isolation kits reveals kit-dependent biases

BioTechniques, Vol. 59, No. 1, July 2015, pp. 13–17

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