专家指导:如何进行唾液收集与实验操作

【字体: 时间:2015年07月13日 来源:生物通

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  “在过去的几年中,唾液的用处得到了不少人的认可,”来自Oasis Diagnostics公司的CEO Paul Slowey说。其中一大原因是目前的一些技术都能敏感的检测分析和定量唾液中的DNA,RNA,代谢物和蛋白,这些成分在唾液中的水平含量要比在血液中的浓度要低100-1400倍。

生物通报道:健康成人三个主要的腺体每天大约要分泌1至1.5升的唾液,这些唾液中大部分是水,其它还包括电解质和蛋白质,例如形成粘液,分解食物和细菌的酶,以及分泌抗体所需的糖蛋白。

除了维护我们的口腔健康,通过唾液科学家们还能了解关于我们祖先,我们是否能对抗某种感染病原体,以及激素失衡的线索。未来这种液体甚至还能进行心脏病快速筛选,区分细菌还是病毒感染。实际上,唾液也能帮助研究人员了解口腔微生物组的特征,以及健康与疾病之间的潜在关联。

“在过去的几年中,唾液的用处得到了不少人的认可,”来自Oasis Diagnostics公司的CEO Paul Slowey说。其中一大原因是目前的一些技术都能敏感的检测分析和定量唾液中的DNA,RNA,代谢物和蛋白,这些成分在唾液中的水平含量要比在血液中的浓度要低100-1400倍。

虽然唾液相对于血液来说,更加容易收集,存储和运输,也更便宜,但是相关的流体研究和新型唾液,口腔诊断技术却并不方便和简单。因此设计相关的实验需要考虑已商业化可用的工具,合适的流程,稳定性,以及出现问题的策略。这些因素都会影响你的结果,尤其是如果你希望能定量分析的话。近期The Scientist杂志就总结了几位唾液研究专家,分享他们的秘诀。

 

样品类型

全口腔唾液

这里包括唾液液体和所有的额外物,如来自口腔,鼻黏液的细胞,来自口部和口疮的血液,还有肠道菌群和食物残渣。通过口水或吐痰都可以收集到试管中。为了增加收集量,你也可以通过咀嚼一些不会干扰实验的东西来刺激唾液分泌,如原味口香糖,蜡或硅管之类的东西。此外在口香糖,漱口水和糖果中添加柠檬酸,也能增加唾液的分泌。

口腔黏膜渗出液和牙龈沟液

这些液体也会出现在口水中,但比全口腔唾液更能反应血液成分,来自纽约大学的颅面生物学,艾滋病研究组主任Daniel Malamud教授说。

而且这些液体也是检测IgG抗体这些口腔中有限成分的一个好来源。例如,美国食品药品管理局批准的OraQuick ADVANCE Rapid HIV-1/2 Antibody Test,这种检测方法收集的是黏膜渗出液中的抗体。黏膜渗出液是流经粘膜上皮表面的一种超滤血,受试者只需手持一种特制医用海绵在上牙和牙龈以及下牙和牙龈之间滑动,以采集生物样本。使用者随后把海绵塞入一个小型测试仪器,等待20至40分钟,即可知道自己是否感染艾滋病毒。

这种快速口腔艾滋病检测仪在2012年获得了美国食品与药物管理局的许可,是目前唯一一种得到了美国政府许可的口腔艾滋病检测仪。

而牙龈沟液则是牙齿和牙龈缝隙之间的液体,“你可以通过纸棒进行收集,”Malamud说,“虽然这只有几个微升,但是研究人员可以进行生化分析实验。”

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分析对象是什么

DNA

唾液研究最活跃的领域之一就是从中寻找上皮细胞和白细胞的DNA进行分析,目前不少科学家们正在唾液中寻找与囊肿性纤维化(囊性纤维化)、自闭症和其他疾病相关的基因。像是Oasis Diagnostics公司就已经验证了其设备DNA•SAL 能用于多种遗传疾病和患病风险的检测,其中包括戈谢氏病、地中海贫血症和心血管疾病等。

其它也有不少公司除了提供样品收集工具,也提供保存唾液样品的提取试剂盒,此前发表在Journal of Visualized Experiments上的一个操作手册就详细介绍了从唾液中提取DNA,用于新一代测序技术分析的全过程。(原文标题:Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing)

此外,尽管唾液成分各有不同,但是大约30%唾液口水中的DNA来自于口腔中的细菌。NEB公司有一种细菌DNA富集提取试剂盒:NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit,采用一种新方法将微生物DNA与宿主DNA分离,降低测序成本。

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RNA

利用RNA能检测到除了口腔疾病之外的疾病,来自加州大学洛杉矶分校的David Wong等人发现唾液中的某些RNAs与口腔以及其它癌症发生有关,文章标题为:Salivary microRNAs and oral cancer detection,采用的方法是绘制唾液miRNAs图谱,同时这篇文章也介绍了一种样品收集工具(可收集核酸和蛋白),即RNAPro•SAL。此外还有其他一些研究人员研发了从唾液细胞中分离RNA的方法(High-Yield RNA-Extraction Method for Saliva)。

唾液中大部分RNA也是来自于口腔中的细菌,Wong研究组的一项成果指出增加一步低速离心,能提高测序的深度,减少细菌RNA的干扰(The Human Salivary RNA Transcriptome Revealed by Massively Parallel Sequencing)。

多肽和蛋白质

约30%在血液中发现的蛋白也会出现在唾液中,具体包括细胞因子、激素、生长因子和抗体等。研究人员也正在评估唾液蛋白作为潜在炎症、阿尔茨海默氏症和糖尿病的可能性。从技术上值得注意的是,蛋白也与RNA一样,容易受到酶的攻击,因此需要不同的收集方法。





如何收集

总体来说唾液收集没有统一的方法,这要考虑到参与实验人员的年龄,以及即将进行何种实验。而这种收集方式,以及样品在口腔中位置和收集时间会造成影响。

“收集(过程)不同,将难以比对自己的结果与其它实验室的结果,”Wong说,这对于希望能用于临床的生物标记研究来说尤为重要。

不同唾液分析物收集的一个金标准就是Passive drool,即实验参与者让口腔中的唾液自然汇集,然后身体前倾,让其流入一个试管中,但是这对于一些患者来说并不容易。

当研究人员的研究对象是早产儿和新生儿的时候,那么就需要婴儿的一个最常见的动作:吸吮,不过现在临床研究人员研发了一种Pedia•SAL新工具,这种设备能与安抚奶嘴连接在一起,帮助收集婴儿唾液。

还有一些工具也能通过吸取唾液进行收集,关键在于找到一个适合你目标分子的工具,“我们都知道如果用泡沫或棉花吸收唾液样本,有可能会以我们不知道的方式改变样品的完整性。因此根据你的目标分子来决定样品是否能用,”亚利桑那州大学跨学科唾液生物科学研究所所长Douglas Granger说,他同时也是Salimetrics 的创始人。


如何提高收集量

通过passive drool方法能获得足够量的样品,但是如果你需要刺激唾液分泌,那怎么办呢?

今年的一项肉食性摄入研究表明,微博熏肉的香味能促进唾液流量,同时也不会干扰激素浓度。(New Techniques for Augmenting Saliva Collection: Bacon Rules and Lozenge Drools)

除此之外,还有止咳糖、漱口水和口香糖都可以刺激唾液流量。当然首先需要确定这些刺激方法不会干扰目标物的检测,比如漱口水有可能会冲淡你的样品,Malamud说。

他也警告说,“非刺激唾液是通过吐到杯子中,还是通过像我们这样的刺激工具进行收集,也会影响结果,”改变唾液量有可能会改变某些分析物的浓度。

除了刺激唾液量,还有许多因素会影响唾液的分泌速度,如年龄、运动、吸烟习惯、饮酒、时间和整体口腔健康等,个人唾液分泌速度也是定量研究必不可少的数据,一些研究人员会直接检测个人分泌速度:收集唾液量除以所花的时间。

另外一种方法就是采用新设备,来自加州大学洛杉矶分校的Vivek Shetty与他的同事就开发了这样的一种装置,目前可以通过日本Nanbu Irika公司购买这种设备,每个约为10美元(当地价格),30个280美元。
 

如何保存样品

唾液中含有多种可以快速降解你目标物的酶,一些目标分子,如皮质醇或褪黑激素在室温下要比其它成分更为稳定,但是一般情况下,最好还是在样品收集后立刻放到冰箱中冷藏,同时在冷冻起来之前也需要进行纯化。Slowey说。

纯化方式一部分取决于你的目标分子是在细胞内还是细胞外,这两个存在方式目前也都有试剂盒可用,如细胞外RNAs,研究人员可以离心细胞,分析或者冷冻上清液;如果是研究人类DNA,那么就可以采用细胞裂解,亲和绑定基因组DNA,洗脱其它成分。

一些稳定Buffers(Norgen,Qiagen等品牌都有)能用于中和降解DNA和RNA的酶,如果样品收集后无法麻烦放回冰箱,那么就可以利用这些试剂盒进行保存,如Qiagen 的RNAprotect Saliva Reagent,还有DNA Genotek的人类DNA,RNA收集试剂盒等。

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而对细菌DNA和RNA感兴趣的研究人员来说,DNA Genotek的OMNIgene 试剂盒也是理想的长期保存方式,来自澳大利亚格里菲斯大学的David Speicher说。

蛋白是最不稳定的分析物,许多DNA和RNA的稳定试剂都不能保护蛋白,为了解决这个问题,Wong研究组在2012年的一篇文章中提出了一种稳定技术,就是预添加到RNAPro•SAL收集管中 (Method development for proteome stabilization in human saliva)。
 

冷冻保存时间

–80℃冰箱可以长期保存唾液,但是这也是有期限的,Speicher研究组最近的研究提出了警告:无添加稳定溶液的唾液DNA,即使是保存在–80℃冰箱,14个月后就已经部分或完全降解了(Detecting DNA viruses in oral fluids: evaluation of collection and storage methods)。

因此一般来说最好样品分装,减少冷冻-解冻周期。

最后科学家们建议,如果你看了许多综述,深入了解了唾液的收集和处理之后依然不成功,那么可以打电话请教,“大多数科学家们都是乐于分享的,”Malamud说。

(生物通:张迪)

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