技术指南：从组织样品中提取核酸（二）[选购宝典]

物以稀为贵，肿瘤样品也是如此。通常，珍贵的材料都是以FFPE样品保存的。这个蕴藏了丰富信息的宝库，在开采起来也并非那么容易。从FFPE样品中纯化DNA或RNA时，我们要面对不少困难。如何应对？请看下文。

物以稀为贵，肿瘤样品也是如此。通常，珍贵的材料都是以FFPE样品保存的。这个蕴藏了丰富信息的宝库，在开采起来也并非那么容易。从FFPE样品中纯化DNA或RNA时，我们要面对不少困难。首先，这些生物分子彼此交联，而交联程度和不可逆交联的比例部分取决于福尔马林固定的持续时间。其次，核酸常常严重片段化，这取决于FFPE样品如何制备和保存。

脱蜡

由此可见，从FFPE组织中提取核酸需要一些额外的步骤。第一步是溶解石蜡然后去除，暴露样品。多种溶剂可用于脱蜡，一般二甲苯用得最多。二甲苯处理后，再用浓度逐步降低的乙醇（100%、90%、70%）进行洗涤，以去除二甲苯。在脱蜡后，组织必须重新水化，再进行裂解，之后才是提取。

有时候，脱蜡需要多次洗涤，这会导致样品损失。对于稀少或珍贵的样品而言，这更是一个大问题。这时，可以考虑一些步骤较少的试剂盒。Epicentre的QuickExtract™ FFPE DNA Extraction Kit利用加热来融化石蜡并裂解细胞。QIAGEN也提供了一种新型脱蜡溶液（Deparaffinization Solution）。将其加入FFPE样品之后，溶液浸泡样品，同时开展蛋白酶K消化。在加入脱蜡溶液后无需沉淀FFPE样品，也无需去除含有石蜡的上清。因此避免了脱蜡过程中样品损失的风险。

提取

对于FFPE样品的核酸提取，很多厂家都提供了相关的试剂盒，比如QIAGEN、Promega、Life Technologies等。需要注意的是，在DNA提取过程中，最关键的步骤就是利用蛋白酶K消化蛋白。这个过程可以从几小时一直到几天。专家认为，延长消化时间能改善DNA的回收率以及片段的平均长度。然而，现在的试剂盒都经过了一些优化，不需要过夜孵育，但你要确保消化完全。

而RNA的纯化也同样面临交联的问题。不过，由于RNA在热处理时更容易片段化，有些试剂盒降低了蛋白酶K的孵育温度。例如，QIAGEN的RNeasy FFPE Kit采用56°C和80°C相结合的孵育。当然，有的试剂盒还能保留小分子RNA，如miRNA。不过，鉴于RNA的片段化，单独纯化小分子RNA是不切实际的。

当然，如果需要同时提取DNA和RNA，你可以试试Ambion的RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE。这个试剂盒使用二甲苯和乙醇洗涤进行脱蜡，接下来是蛋白酶消化。之后利用快速的玻璃过滤器进行核酸纯化。整个手工操作的时间大约在45分钟。终产物包括总RNA、miRNA和基因组DNA。回收的核酸适用于新一代测序、实时定量PCR和芯片分析等。如果是高通量分析，MagMAX™ FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit可能更理想。

除了这些常规的方法，还有一些新技术值得我们关注，比如Covaris的自适应聚焦声波（AFA）技术，它在FFPE样品的提取中也有一些优势。

Covaris的truXTRAC™方法利用高度控制的聚焦声波能量，对FFPE样品进行脱蜡并水化，之后通过磁珠法（自动）或离心柱（手动）纯化核酸。大多数传统的脱蜡方法都使用5-10 μm厚的组织切片，但Covaris方法不受到FFPE组织厚度的限制，能提取出高品质的核酸。

对于高通量的形式，truXTRAC试剂盒包括8支microTUBE联管，可以标准的微孔板形式处理96个样品。利用Covaris LE220聚焦超声发生器，96个样品的脱蜡可以在1小时内完成。此外，DNA剪切步骤也能整合到truXTRAC流程中，大大简化了新一代测序的文库制备。之前，Covaris还展示了通过此方法制备的DNA样品的测序结果。在对比实验中，truXTRAC不仅表现出更高的产量，也展现了与新鲜冷冻组织一致的覆盖均一性。（生物通 余亮）

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