跟着论文做实验:DNA修复的快速分析[创新技巧]

【字体: 时间:2015年07月15日 来源:生物通

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  目前测定DNA修复活性的分析大约需要许多天才能完成,使用放射性标记的3H-胸苷或BrdU,这些分子在S期掺入DNA。它们与DNA碱基的结构相似,因此在添加到细胞中时,它们能逐渐掺入DNA。为了测定掺入分子的量,人们需要使用放射自显影或闪烁计数器。当然,这些分析不适合高通量的研究。

DNA损伤的修复是细胞中的一个关键过程。核苷酸切除修复(NER)是主要的DNA修复过程,它试图去除紫外线或化学诱导的DNA损伤,让复制或转录得以继续。若NER过程中的基因发生突变,则会引起一些疾病,比如着色性干皮症或Cockayne综合征。这些患者极易出现黑色素瘤和其他健康问题,因为他们无法修复因日晒或其他因素引起的DNA损伤。

目前测定DNA修复活性的分析大约需要许多天才能完成,使用放射性标记的3H-胸苷或BrdU,这些分子在S期掺入DNA。它们与DNA碱基的结构相似,因此在添加到细胞中时,它们能逐渐掺入DNA。为了测定掺入分子的量,人们需要使用放射自显影或闪烁计数器。当然,这些分析不适合高通量的研究。

日本的研究人员在《Nature Protocols》上介绍了一种方法,能快速分析DNA损伤的修复。这种方法使用了5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)或5-乙炔基尿苷(EU)。这些分子与BrdU相似,作为核苷类似物在S期掺入DNA。不过,需要添加叠氮化物和铜来催化click反应 – 叠氮化物和炔烃之间的共价反应。反应所产生的荧光信号可通过任何高内涵成像系统检测,并且比BrdU更加灵敏。

(图片来自原文)

研究人员开发实验方案来评估UDS(程序外DNA合成)和RRS(DNA损伤后RNA合成的修复)。诱导DNA损伤后,添加EdU来实现DNA掺入。随后进行固定和阻断,并加入荧光叠氮化物染料,之后进行DAPI染色。这些培养板可以在高内涵的读取仪上读取,这样整个过程就是半自动化的。

此外,他们还发现,类似的方案也适合快速测定细胞对DNA损伤试剂的敏感性,以及基于病毒的基因互补分析,这可用来系统地确定与DNA修复缺陷疾病相关的致病基因。如果你近期正要开展这些分析,不妨读读这篇文章,他们的实验方案很详细。(生物通 余亮)

原文检索

A rapid, comprehensive system for assaying DNA repair activity and cytotoxic effects of DNA-damaging reagents

Nature Protocols 10, 12–24 (2015) doi:10.1038/nprot.2014.194

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