跟着论文做实验：DNA修复的快速分析[创新技巧]

DNA损伤的修复是细胞中的一个关键过程。核苷酸切除修复（NER）是主要的DNA修复过程，它试图去除紫外线或化学诱导的DNA损伤，让复制或转录得以继续。若NER过程中的基因发生突变，则会引起一些疾病，比如着色性干皮症或Cockayne综合征。这些患者极易出现黑色素瘤和其他健康问题，因为他们无法修复因日晒或其他因素引起的DNA损伤。

目前测定DNA修复活性的分析大约需要许多天才能完成，使用放射性标记的3H-胸苷或BrdU，这些分子在S期掺入DNA。它们与DNA碱基的结构相似，因此在添加到细胞中时，它们能逐渐掺入DNA。为了测定掺入分子的量，人们需要使用放射自显影或闪烁计数器。当然，这些分析不适合高通量的研究。

日本的研究人员在《Nature Protocols》上介绍了一种方法，能快速分析DNA损伤的修复。这种方法使用了5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）或5-乙炔基尿苷（EU）。这些分子与BrdU相似，作为核苷类似物在S期掺入DNA。不过，需要添加叠氮化物和铜来催化click反应 – 叠氮化物和炔烃之间的共价反应。反应所产生的荧光信号可通过任何高内涵成像系统检测，并且比BrdU更加灵敏。

（图片来自原文）

研究人员开发实验方案来评估UDS（程序外DNA合成）和RRS（DNA损伤后RNA合成的修复）。诱导DNA损伤后，添加EdU来实现DNA掺入。随后进行固定和阻断，并加入荧光叠氮化物染料，之后进行DAPI染色。这些培养板可以在高内涵的读取仪上读取，这样整个过程就是半自动化的。

此外，他们还发现，类似的方案也适合快速测定细胞对DNA损伤试剂的敏感性，以及基于病毒的基因互补分析，这可用来系统地确定与DNA修复缺陷疾病相关的致病基因。如果你近期正要开展这些分析，不妨读读这篇文章，他们的实验方案很详细。（生物通 余亮）

原文检索

A rapid, comprehensive system for assaying DNA repair activity and cytotoxic effects of DNA-damaging reagents

Nature Protocols 10, 12–24 (2015) doi:10.1038/nprot.2014.194