现代细胞遗传学实验室必备的工具

【字体: 时间:2015年07月16日 来源:生物通

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  早在20世纪50年代,人们就将异常的遗传结构与人类疾病相关联。当时,他们发现唐氏综合征患儿多了一条染色体,而特纳综合征患者的性染色体异常。不久之后,13三体和18三体也被发现。自那以后,更多先进的细胞遗传学工具就用来发现疾病状态下的染色体异常,甚至找到病因,并给出治疗建议。

早在20世纪50年代,人们就将异常的遗传结构与人类疾病相关联。当时,他们发现唐氏综合征患儿多了一条染色体,而特纳综合征患者的性染色体异常。不久之后,13三体和18三体也被发现。自那以后,更多先进的细胞遗传学工具就用来发现疾病状态下的染色体异常,甚至找到病因,并给出治疗建议。

现代的细胞遗传学实验室在寻找染色体异常时,可不仅仅使用吉姆萨染色和荧光原位杂交(FISH)。这些工具“不会消失,因为对于任何结构变异或平衡易位、倒位,即使是低水平的镶嵌,(这些)都是带给你整个基因组的空间结构的唯一方法,”Greenwood遗传学中心细胞遗传学实验室的主任Alka Chaubey谈道。但是对于最普遍的异常,如导致拷贝数变异(CNV)的插入和缺失,标准工具已变成芯片。

在此,我们看看研究人员如何使用这些工具(包括第二代和第三代测序技术),来发现那些可能引起疾病的结构异常。

芯片主力军

一位训练有素的细胞遗传学家可以从分辨率达几Mb的核型图中找到染色体畸变。而某些FISH技术(如fiber FISH)的分辨率可达几Kb,但它们每次只能查看一段或几段序列。

为了在更大规模上实现这种分辨率,细胞遗传学家开始借助芯片。芯片的固体表面上结合了寡核苷酸(60-mer),它们与片段化的染色体样品杂交。对于比较基因组杂交芯片(aCGH),绿色荧光基团标记的待测样品与红色荧光基团标记的对照样品(或反之亦然)混合,这两者竞争着与寡核苷酸探针结合。绿色信号代表拷贝数的增加,红色信号代表DNA片段的丢失,而黄色信号表示没变化。一些芯片只让待测样品与探针杂交,而信号强度代表拷贝数。

据Affymetrix遗传分析业务部门的高级副总裁Kim Caple介绍,随着罗氏不再供应NimbleGen芯片,如今北美地区有三个主要的供应商:安捷伦、Illumina和Affymetrix。而Oxford Gene Technology(OGT)是欧洲的主要供应商。(Chaubey指出,OGT和安捷伦在本质上是相同的。)

这些公司的芯片存在一些差异,比如基本技术、使用平台、探针密度等,但从整个过程来看,所有芯片产品的流程都是相似的,Caple谈道。


CNV芯片可以覆盖整个基因组,也可以针对一组特定的基因 – 要么是现成的,要么是定制的。例如,如果患者患有自闭症或癫痫,Greenwood使用Affymetrix的CytoScan芯片。此平台有270万个探针,有着良好的基因覆盖;而SNP实现了单亲二倍体和常染色体隐性疾病的鉴定。不过有一样东西是它缺乏的:对每个基因的每个外显子的覆盖。因此如果怀疑是X连锁的异常,Greenwood有时就会运行更有针对性的OGT CytoSure™ Chromosome X芯片。“它覆盖了X染色体上的所有基因,那些基因的每个外显子,”Chaubey指出。

尽管60-mer寡核苷酸能够发现待测样品中是否含有互补序列,但它们无法判断这些序列在基因组的哪个位置。举个例子,同一条染色体上相距1 Mb的重复与不同染色体上的重复看上去是一样的。同样,易位序列检测起来也像正常一样。

测序新生代

Greenwood的临床遗传学家Mike Lyons就使用芯片作为一线的基因检测,并辅以核型分析,以确保没有一些芯片无法发现的重排。如果没有给出答案,他就会订购一种NGS检测 – 如自闭症集合,查看与自闭症相关的80多个基因,希望能够这些已知相关的基因中找到异常。不过对于“非综合征或非特异的发育或智力残疾,外显子组测序更有助于诊断,”Lyons说。

随着外显子组数据库的改善,目前已经有更好的算法来过滤掉意义不明的变异(VOUS),“外显子组可能成为更加一线的检测,”Lyons谈道。至于全基因组测序(WGS),“数据量太大了,在临床环境下对多个不同患者进行这种检测令人生畏,因此我们临床上还没做。”

NGS能够检测缺失和重复,且分辨率比其他的细胞遗传学技术高出不止一个数量级,有了双端的制备和分析技术,NGS还能检测断裂点和平衡事件,如倒位和易位,华盛顿大学的教授Evan Eichler指出。不过,若这些落入大的、高度重复的基因组序列中,NGS一般是无法准确定位断裂点的。

这就是所谓的第三代测序崭露头角的地方。据Pacific Biosciences的首席科学家Jonas Korlach介绍,最新的P6-C4试剂实现了>10,000 bp的平均读长,且许多读长超过30,000 bp。这些长的读取让PacBio能够跨越短读取测序的缺口。

BioNano Genomics的技术也能弥补这一缺口,Chaubey谈道。与测序不同,BioNano的光学纳米通道Irys系统检测以特定荧光探针标记的高分子量的DNA分子,从而获得拷贝数变化和结构变异的信息。

也许有一天,基因组的de novo组装让传统的细胞遗传学变得过时。根据序列,我们不仅能了解每个SNP,也能读取每个结构畸变。不过,就目前而言,诊断和临床研究仍主要是通过芯片和NGS来开展,偶尔需要做一下FISH。

我有兴趣了解Affymetrix的CytoScan芯片

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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