现代细胞遗传学实验室必备的工具

早在20世纪50年代，人们就将异常的遗传结构与人类疾病相关联。当时，他们发现唐氏综合征患儿多了一条染色体，而特纳综合征患者的性染色体异常。不久之后，13三体和18三体也被发现。自那以后，更多先进的细胞遗传学工具就用来发现疾病状态下的染色体异常，甚至找到病因，并给出治疗建议。

现代的细胞遗传学实验室在寻找染色体异常时，可不仅仅使用吉姆萨染色和荧光原位杂交（FISH）。这些工具“不会消失，因为对于任何结构变异或平衡易位、倒位，即使是低水平的镶嵌，（这些）都是带给你整个基因组的空间结构的唯一方法，”Greenwood遗传学中心细胞遗传学实验室的主任Alka Chaubey谈道。但是对于最普遍的异常，如导致拷贝数变异（CNV）的插入和缺失，标准工具已变成芯片。

在此，我们看看研究人员如何使用这些工具（包括第二代和第三代测序技术），来发现那些可能引起疾病的结构异常。

芯片主力军

一位训练有素的细胞遗传学家可以从分辨率达几Mb的核型图中找到染色体畸变。而某些FISH技术（如fiber FISH）的分辨率可达几Kb，但它们每次只能查看一段或几段序列。

为了在更大规模上实现这种分辨率，细胞遗传学家开始借助芯片。芯片的固体表面上结合了寡核苷酸（60-mer），它们与片段化的染色体样品杂交。对于比较基因组杂交芯片（aCGH），绿色荧光基团标记的待测样品与红色荧光基团标记的对照样品（或反之亦然）混合，这两者竞争着与寡核苷酸探针结合。绿色信号代表拷贝数的增加，红色信号代表DNA片段的丢失，而黄色信号表示没变化。一些芯片只让待测样品与探针杂交，而信号强度代表拷贝数。

据Affymetrix遗传分析业务部门的高级副总裁Kim Caple介绍，随着罗氏不再供应NimbleGen芯片，如今北美地区有三个主要的供应商：安捷伦、Illumina和Affymetrix。而Oxford Gene Technology（OGT）是欧洲的主要供应商。（Chaubey指出，OGT和安捷伦在本质上是相同的。）

这些公司的芯片存在一些差异，比如基本技术、使用平台、探针密度等，但从整个过程来看，所有芯片产品的流程都是相似的，Caple谈道。

CNV芯片可以覆盖整个基因组，也可以针对一组特定的基因 – 要么是现成的，要么是定制的。例如，如果患者患有自闭症或癫痫，Greenwood使用Affymetrix的CytoScan芯片。此平台有270万个探针，有着良好的基因覆盖；而SNP实现了单亲二倍体和常染色体隐性疾病的鉴定。不过有一样东西是它缺乏的：对每个基因的每个外显子的覆盖。因此如果怀疑是X连锁的异常，Greenwood有时就会运行更有针对性的OGT CytoSure™ Chromosome X芯片。“它覆盖了X染色体上的所有基因，那些基因的每个外显子，”Chaubey指出。

尽管60-mer寡核苷酸能够发现待测样品中是否含有互补序列，但它们无法判断这些序列在基因组的哪个位置。举个例子，同一条染色体上相距1 Mb的重复与不同染色体上的重复看上去是一样的。同样，易位序列检测起来也像正常一样。

测序新生代

Greenwood的临床遗传学家Mike Lyons就使用芯片作为一线的基因检测，并辅以核型分析，以确保没有一些芯片无法发现的重排。如果没有给出答案，他就会订购一种NGS检测 – 如自闭症集合，查看与自闭症相关的80多个基因，希望能够这些已知相关的基因中找到异常。不过对于“非综合征或非特异的发育或智力残疾，外显子组测序更有助于诊断，”Lyons说。

随着外显子组数据库的改善，目前已经有更好的算法来过滤掉意义不明的变异（VOUS），“外显子组可能成为更加一线的检测，”Lyons谈道。至于全基因组测序（WGS），“数据量太大了，在临床环境下对多个不同患者进行这种检测令人生畏，因此我们临床上还没做。”

NGS能够检测缺失和重复，且分辨率比其他的细胞遗传学技术高出不止一个数量级，有了双端的制备和分析技术，NGS还能检测断裂点和平衡事件，如倒位和易位，华盛顿大学的教授Evan Eichler指出。不过，若这些落入大的、高度重复的基因组序列中，NGS一般是无法准确定位断裂点的。

这就是所谓的第三代测序崭露头角的地方。据Pacific Biosciences的首席科学家Jonas Korlach介绍，最新的P6-C4试剂实现了>10,000 bp的平均读长，且许多读长超过30,000 bp。这些长的读取让PacBio能够跨越短读取测序的缺口。

BioNano Genomics的技术也能弥补这一缺口，Chaubey谈道。与测序不同，BioNano的光学纳米通道Irys系统检测以特定荧光探针标记的高分子量的DNA分子，从而获得拷贝数变化和结构变异的信息。

也许有一天，基因组的de novo组装让传统的细胞遗传学变得过时。根据序列，我们不仅能了解每个SNP，也能读取每个结构畸变。不过，就目前而言，诊断和临床研究仍主要是通过芯片和NGS来开展，偶尔需要做一下FISH。

我有兴趣了解Affymetrix的CytoScan芯片

（作者：Josh P. Roberts / 生物通编译）