干细胞研究者的苦恼：任务太多，样品太少

Mark Kibschull是加拿大Lunenfeld-Tanenbaum研究所的一名专家，他们实验室主要研究妊娠并发症的机制，如先兆子痫和早产。为了更好地了解人胚胎干细胞（hESC）如何发育成组成人体的200多种特化细胞，Kibschull及其同事需要优化hESC的培养条件，并确定诱导分化的生化线索。

为了评估培养条件变化的影响，Kibschull利用实时定量PCR来寻找多能干细胞特有的基因表达模式以及分化的标志。从理论上说，这是一个简单的任务：收集细胞，分离mRNA，开展标准的实时定量PCR分析。不过实践证明这几乎是个不可能的任务。“在分析干细胞时，你的材料只有那么少，而你需要分析几个标志物。利用传统的RNA纯化方法很难实现，”他解释道。

样品太少

在培养过程中，Kibschull将干细胞转移到特殊的培养板中，这迫使细胞聚集成球状结构，又叫拟胚体（EB）。组装成这些3D结构诱导细胞分化成三种细胞谱系：外胚层、中胚层和内胚层。随后他们在六孔板中培养EB，以便获得足够的材料，来寻找这三种细胞类型特有的基因表达模式。他们还研究了不同生长因子促进分化的能力。

一个看似简单的实时定量PCR实验，有时也让人沮丧。“我们的一些培养条件让拟胚体有压力，因此在3周培养结束后，我们只有10或20个拟胚体。这是个问题，因为使用标准的柱纯化，我们至少需要30到50个，”Kibschull说。

同样，在Kibschull及其同事检验新的培养条件是否支持诱导多能干细胞（iPSC）的生成时，样品数量也成为限制。“iPSC的诱导是一个非常繁琐的过程，需要几个星期才能得到足够的材料，”他说。这不仅耗时，也需要大的资金投入，因为生长因子之类的相当贵。Kibschull希望有一个质量控制步骤，比较早期的iPSC克隆与hESC细胞的基因表达谱。这样他才能抛弃那些重编程不完全的iPSC克隆，节省时间和成本。

打破僵局

Kibschull发现自己陷入了僵局，要么样品太少，要么费用惊人。幸好，Bio-Rad新试剂的出现，打破了这种僵局。“Bio-Rad帮助我们开发出一个新颖的流程，让我们只需要100个细胞，就能分析几百个不同的cDNA目标，”他说。

这个方案让Kibschull能够绕过RNA的柱纯化，利用Bio-Rad的SingleShot Lysis Buffer获得无DNA的总RNA裂解液。由于这个流程不包括可能导致样品损失的柱结合、洗涤和洗脱，Kibschull的实验失败率大大下降。“无论我们裂解了什么，我们总是能分析到底，“他说。

尽管SingleShot裂解液绕过了RNA纯化，但Kibschull仍然没有足够的cDNA来分析所需的基因，以便得出有意义的结论。为了解决这个问题，他使用了Bio-Rad的预扩增混合液和引物将100个cDNA富集了1000倍。Kibschull知道预扩增的概念，但他从没想过这么大的规模。“200个引物带来无偏向的扩增 – 我从来没想过，”他说。“我们使用标准方案，没有优化，也很好。”

无需优化也是Bio-Rad的PrimePCR™ Human Embryonic Stem Cell Line Panel的特点。如今Kibschull用它来追踪100个最常分析的多能性和胚层标志物的表达模式。“由于这些引物经过了验证，我们就不需要检查它们的效率和特异性，这也意味着节省了许多工作。”如今这些精力可用来收集数据。“你得到了漂亮的图像，”他解释道，“说明培养条件A、B和C支持多能干细胞状态。”

Kibschull认为，这个新的流程远远超出了他的预期，能够对单个EB或iPSC克隆进行基因表达谱分析。如今，Kibschull能够检测更多的条件，研究更多的基因，而所需的起始材料仅为之前的一小部分。

当然，这个方案的应用还不止这些。Kibschull的一个同事正在分析胎盘分泌的外泌体（exosome）中的RNA。这些囊泡有着微量的DNA，而新的流程也许正适合。他们还希望利用这个方案来克服处理活检样本时常常面对的问题：样本量太少。（生物通 余亮）

了解Bio-Rad为少量样品而设计的定量PCR流程

这个故事来自Bio-Rad：

Too Many Questions, Too Little Sample: Developing a Real-Time PCR Workflow for Monitoring Gene Expression in Limited Samples