免疫学研究,你的工具升级了吗?

【字体: 时间:2015年07月24日 来源:生物通

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  一提到免疫学,你通常会想到根据细胞的大小和粒度以及荧光标记来分析(或分选)大量的细胞。流式细胞仪能够根据抗原受体的存在对免疫细胞进行分型,比如CD4和CD8抗原的表达。细胞内抗原的染色已变得司空见惯,而分泌的蛋白(如细胞因子)甚至也能同时捕获和观察。

免疫系统不仅影响着疾病状态,也影响科学研究 – 从疫苗开发到白血病,从传染病到关节炎,从免疫治疗到自身免疫。这些领域的探索需要运用各种技术和仪器,从细胞毒性分析到质谱分析。这些技术交织在一起,形成协同效应,比如免疫治疗就综合了免疫学和细胞治疗的原理。

每个实验室在研究具体问题时,无疑都有自己的一套技术。不过,一些新的趋势正在兴起。毫无疑问,这并不是免疫学所独有的。但话说回来,免疫学的问题也不属于单个学科。

多维度分析

一提到免疫学,你通常会想到根据细胞的大小和粒度以及荧光标记来分析(或分选)大量的细胞。流式细胞仪能够根据抗原受体的存在对免疫细胞进行分型,比如CD4和CD8抗原的表达。细胞内抗原的染色已变得司空见惯,而分泌的蛋白(如细胞因子)甚至也能同时捕获和观察。

宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室的主任Eline Luning Prak认为:“目前有着更多维度分析的趋势,这样细胞将有着更好的表型分辨率。”这能够在白血病和淋巴瘤治疗后更好地追踪残留疾病,也能够寻找克隆演化。

“最多15种颜色……流式是目前最好的,”斯坦福大学医学院人类免疫监控中心(HIMC)的主任Holden Maecker如是说。不过他提到了另一个更令人兴奋的产品,Fluidigm的CyTOF质谱流式细胞仪。这台仪器有点像流式细胞仪,不过不是利用光检测器来区分荧光标记的抗体,而是利用原子质谱仪来区分同位素金属结合的抗体。

“它真的扩展了你在单管中所能开展的分析,并连接了所有数据,”Maecker解释道。当然,没有什么是完美的。CyTOF仪器要比流式细胞仪贵得多,而且它更慢 – 每秒500个细胞,相对而言流式细胞仪每秒能分析多达10,000个细胞。“当你讨论稀有细胞,或分析500个样品时,这就是真正的差异,”他说。

分析这么多的参数,也往往意味着这种技术会超出我们分析数据的能力。研究人员正在利用概率分组、SPADE和概率状态建模,来分析多色流式细胞仪和CyTOF的数据。Prak指出:“你不能指望你的头脑。你需要建立一个模型,系统地比较同一患者在不同时间的样本,或比较这种疾病和那种疾病的患者,并让电脑说出它们之间的差别,而不仅仅是目测。”

检测新力量

流式细胞仪不仅能分析蛋白质,也能分析RNA。利用Affymetrix的PrimeFlow™ RNA分析,透化的细胞与互补的寡核苷酸探针一起孵育。之后通过分支DNA(bDNA)信号扩增技术和传统的流式细胞仪,可检测RNA。Affymetrix负责eBioscience业务的高级副总裁Dara Grantham Wright表示:“我们最多检测三种RNA,并同时检测五种蛋白质。”

看看Affymetrix如何利用流式细胞仪来分析RNA

默克密理博的SmartFlare™技术也通过连着双链寡核苷酸序列的纳米金颗粒来完成相似的目标。这些探针通过内吞作用进入活细胞。当目标RNA与纳米金颗粒上的“捕获链“结合时,“报告链”被释放,上面的荧光基团会发出荧光,通过荧光检测平台检测到。

组织样本上的RNA原位杂交也可以通过Affymetrix的ViewRNA分析来开展。这种技术让研究人员能查看多个目标的转录本,从而检测编码分泌蛋白(如细胞因子)的RNA,研究非编码RNA,以及寻找抗体难以制备的蛋白的转录本。

新一代测序

单细胞中的RNA也可以通过NGS来发现。“我们称之为靶向RNA-Seq。通常,我们分选单个T细胞,要么使用四聚体作为探针,这样我们就有了抗原特异的T细胞。或者,如果我们有肿瘤的活检标本,我们就拿到所有T细胞,因为我们认为它们的存在肯定有原因,”Maecker解释道。“之后我们开展cDNA合成,并扩增我们感兴趣的大约70个基因,包括T细胞受体(TCR)。这样我们就得到了每个细胞的TCR序列,我们也得到了其他一堆基因的表达水平。

通过查看TCR序列,“我们能够看到克隆的历史,我们也能查看这些克隆的表型,“Maecker补充道。“这是我们第一次将特异性和表型相联系,否则是做不到的:要么做测序,要么做表型分析。”

有了清楚定义的序列条形码(作为标签),人们能将数百个孔的cDNA合并在单个深度测序运行中,使得单细胞靶向RNA-Seq更加专注,也便宜得多。

当然,NGS也可以用来查看整个基因组。例如,“免疫组库分析 – 对B细胞受体和TCR重排的高通量测序是研究界的一个主要领域,”Prak认为。“它目前尚未应用于临床,但我想可能快了。它适合微小残留病的检测,最终也许适合自身免疫的分析。”

真正将免疫学捆绑在一起的是对免疫系统的关注。我们试图理解先天性和特异性免疫的工作方式,以及它何时会导致疾病,比如淋巴瘤、自身免疫或移植排斥。而我们使用免疫系统及其产物来进行研究和治疗干预。从前沿实验室的最新进展到经过检验的常规方法,我们从不缺少工具。

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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