跟着论文做实验：确定激酶的磷酸化位点

激酶参与了生物体的多个过程，人们也希望准确测定这些酶的磷酸化位点。对于这些翻译后修饰，一种研究方法是将蛋白底物消化成肽段，接着进行质谱分析。尽管这种方法能够确定磷酸化位点，但是当多个位点存在时，很难确定哪些位点同时存在于特定底物上。

完整蛋白的top-down分析为全面鉴定蛋白质提供了一个理想的平台，特别是鉴定这些蛋白中同时发生的翻译后修饰。荷兰乌德勒支大学的研究人员也使用这种分析方法，并在Orbitrap Fusion质谱仪中片段化。这台仪器融合了四级杆、线性离子肼以及Orbitrap质量分析器。然而，top-down分析的瓶颈在于序列覆盖率不足，这是因为蛋白片段化不完全。

于是，研究人员采用多种单个或连续的片段化方法，以确定组合方法是否会带来好处。他们的研究对象是17.5 kDa的Bora蛋白，这是Aurora A（AurA）和Polo样激酶1（PLK1）的底物。他们发现，电子转移解离（ETD）以及高能碰撞解离（HCD）的组合（称为EThcD）带来了Bora的最佳覆盖度（~75%），并保留了不稳定的PTM位点。

研究人员检验了两个时间点，发现Aurora A对Bora磷酸化达3次，而时间延伸到2小时，每个蛋白有4次磷酸化事件。Polo样激酶1也在2小时内进行了4次磷酸化。Aurora A的第一个磷酸化位点是S64，但第二次是在三个位点中的一个：T149、S48或T20。对于PLK1磷酸化，T43是第一个位点， S89是第二个位点；而S37或S64 是第三个磷酸化位点。这种方法实现了不同磷酸化位点以及两种激酶的磷酸化序列的鉴定。

作者认为，Fusion上的EThcD是可行的，与单独使用HCD或ETD相比能够提供更丰富的片段化图谱，提高蛋白序列覆盖率，从而有助于磷酸化位点的定位。这种方法适用于30 kDa以下的任何蛋白，不过他们提醒，数据仍然需要人工解释，才能对磷酸化位点的定位有信心。（生物通 薄荷）

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原文检索

Benchmarking Multiple Fragmentation Methods on an Orbitrap Fusion for Top-down Phospho-Proteoform Characterization

Anal. Chem., 2015, 87 (8), pp 4152–4158