冷冻电镜：一次又一次的分辨率突破[创新技巧]

过去两年对于冷冻电子显微镜（cryo-EM）而言，是让人兴奋的，甚至可以说是革命性的。到2014年底，两个3.2 Å分辨率的结构通过这种方法确定：一个是β半乳糖苷酶，另一个是酵母线粒体核糖体的大亚基。

冷冻电镜达到3 Å的分辨率，这本身就是一个很大的成就，标志着结构生物学进入新时代。那些一直在用X射线晶体学来实现原子分辨率的研究人员也开始涌向冷冻电镜，试图以此来分析那些不适合结晶的分子。

不过，科学界认为还需要一些大的技术进步才能突破3 Å。这个分辨率对药物设计而言很有意义，因为这样才能观察水分子、盐桥和氢键。

大约一年前，斯克里普斯研究所的Bridget Carragher和Clint Potter正在研究700-kDa的嗜酸热原体（Thermoplasma acidophilum）的20S蛋白酶体，这个酶对细胞中错误折叠或过量蛋白的去除很重要。他们开始着手研究是否有分辨率的极限。

Carragher、Potter及其团队花时间来优化他们的仪器，让一切都“恰到好处”。他们采用了一种比较慢的操作，但绝不会损失分辨率。当然，科学家们用了顶级的设备：FEI的Titan Krios显微镜，配备Gatan的K2 Summit检测器。

他们是最早突破3 Å极限的研究团队之一，在今年3月以2.8 Å的分辨率解析了蛋白酶体的结构。几乎同时，德国马克斯-普朗克生物物理化学研究所的研究人员以2.65-2.9 Å分辨率，确定了大肠杆菌70S核糖体与延伸因子Tu所形成的复合物的结构，而加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Hong Zhou团队以2.9 Å的分辨率解析了炭疽保护性抗原孔的结构。

挑战在哪里

在单粒子冷冻电镜中，蛋白悬浮液在液氮温度下冷冻，并在电子显微镜中以高分辨率成像。这种方法已经存在了30多年，它有望分辨那些较大的结构，而分辨率与X射线结晶学相当。尽管冷冻电镜有不需要结晶的好处，但它的主要挑战是，生物标本只能忍受低的电子剂量，一旦高了，就会降解。直到几年前，通过传统检测方法（CCD照相机）获得的最佳分辨率仍然是10-15 Å。

“这就像在晚上照相，而不使用闪光灯，”霍华德•休斯医学研究所的研究人员Eva Nogales谈道。“我们的处理方式是收集同一对象的许许多多图像。”然而，噪声图像很难对齐。

这一切都随着新的直接检测技术而改变，这种技术直接检测电子，而不是将它们转换成光，再转换回电子。这种检测器的噪声更小，速度更快，让研究人员能够收集足够的帧数，从而制作出小视频。这样，人们也能够校正因电子与标本的相互作用而引起的微小动作。

结果是产生了更多的图片。更多的数据意味着更大的计算负担，但软件工具也在同步开发。因此，据Nogales介绍，利用直接检测器，图像质量比之前使用CCD照相机好了100倍。过去需要几年才能完成的工作，如今在理想的情况下，可在一两天内完成。

有了如此高级的工具箱，研究人员能够在短时间内突破3 Å的分辨率极限。

去年，美国国家癌症研究所的Sriram Subramaniam及其团队以3.2 Å的分辨率解析了β半乳糖苷酶之后，他们并不满足。“我们做了许多标本，但没有真正的方法去评估哪个是好的，哪个不是，”他说。于是他们搜寻了多个标本，发现偶尔能接近2.5 Å。

最困难的部分在于发现哪里需要改变。仪器是相同的，而标本制备、成像和数据处理经过了改进。研究小组最终采集了最好的数据，并系统地评价了哪一部分的数据最有用。这项成果于5月发表在《Science》杂志上，达到了冷冻电镜目前最高的分辨率：2.2 Å。（延伸阅读：Science：革命性技术获得新突破）

未来在何方

如今，结构生物学家正在购进新的显微镜或增加他们已经拥有的。作为纽约结构生物学中心Simons电镜中心的管理者，Carragher和Potter迎来了一台新的Krios。他们希望它能够在今年年底之前开始运行。普渡大学的电镜中心也刚刚收到了一个新的K2 Summit直接电子检测器，用于他们的Titan Krios显微镜。

在购买K2之前，普渡大学Michael Rossmann实验室的博士后研究员Lei Sun花了大量的时间，试图利用结晶学获得噬菌体T4门户蛋白的结构，这个蛋白对基因组包装和启动衣壳组装很重要。她所能获得的最佳分辨率是6.5 Å。

在使用了UCLA的直接检测器之后，Sun能够获得团队所需的数据 – 3.6 Å分辨率的结构。她们的工作发表在7月的《Nature Communications》上，揭示了这个蛋白为什么难以结晶：它有着可变数量的分子结构单元。尽管人们认为复合物有12个亚基，但一些有11个，而另一些有13个。

有了新的检测器，Rossmann计划要做的第一件事就是确定肠道病毒D68（EV-D68）最新分离株的结构。这个病毒在去年导致美国数千名儿童患上呼吸系统疾病。今年1月，他的研究小组解析了EV-D68之前的分离株与pleconaril（一种抗鼻病毒药物）结合的晶体结构。由于EV-D68难以结晶，研究小组希望冷冻电镜能带来好运气。

不过，冷冻电镜在技术上仍具有挑战性，而实现高分辨率的技术仍掌握在少数科学家的手中。“我们现在看到的许多结构其实已经研究了很多年，”马克斯-普朗克生物物理研究所的结构生物学家Werner Kühlbrandt谈道。在这些长期的项目中，人们一直在辛勤而艰难地纯化和稳定分子，对于它们而言，冷冻电镜的时机已经成熟。不过，越来越多的项目将要解析不太熟悉的结构，因此可能还需要优化。

更重要的是，目前已解析的结构都是大的、刚性的，在大多数情况下是对称的。与此相反，膜蛋白复合物以及与药物设计有关的其他大分子复合物都是灵活的。

即使是人们熟悉的β半乳糖苷酶，冷冻电镜的操作也不是太精细，Subramaniam说。他的研究小组希望将重点放在样品制备上，而将分辨率再推进一步。他们也想了解新方法的哪些方面将更普遍适用。“我们需要了解不同的蛋白质如何表现得更好，才能推广这个，”他说。

当然，乐观的精神也很重要。“我们现在终于解决了这个问题（突破3 Å分辨率），梦想成真，”Kühlbrandt谈道。“即使在2年前，也很少人会相信这个。”（作者：Kelly Rae Chi / 生物通编译）

参考文献

Bartesaghi A, Merk A, Banerjee S, Matthies D, Wu X, Milne JL, Subramaniam S. Electron microscopy. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 2015 Jun 5;348(6239):1147-51.

Sun L, Zhang X, Gao S, Rao PA, Padilla-Sanchez V, Chen Z, Sun S, Xiang Y, Subramaniam S, Rao VB, Rossmann MG. Cryo-EM structure of the bacteriophage T4 portal protein assembly at near-atomic resolution. Nat Commun. 2015 Jul 6;6:7548.

Liu Y, Sheng J, Fokine A, Meng G, Shin WH, Long F, Kuhn RJ, Kihara D, Rossmann MG. Structure and inhibition of EV-D68, a virus that causes respiratory illness in children. Science. 2015 Jan 2;347(6217):71-4.