利用CRISPR/Cas9来绘制4D核组[创新技巧]

CRISPR的新成果一直层出不穷。不久前，科学家们开发出一个多彩的系统，利用荧光标记的Cas9来标记活细胞的多个基因组位点。尽管在其他系统上也用过这一招，但CRISPR的简便易用使得它能真正发挥优势。Thoru Pederson实验室开发的这一技术让我们离4D核组（4D nucleome）的绘制又近了一步。

多彩系统

即使没有核酸酶的活性，dCas9（dead Cas9）也有许多应用，最广为人知的是转录激活/抑制。人们之前曾利用dCas9对一段与gRNA相匹配的序列进行荧光标记，促进特定位点的染色质动力学研究。这个系统的限制在于单色标记；多色标记可实现多个位点的观察。

为了创建彩色的Cas9工具箱，Ma等人转向了SpCas9及其同源的NmCas9和St1Cas9。每个同源物都与不同的荧光蛋白融合，以形成三种颜色。这些同源物的特异性是关键：由于每个所需的PAM序列不同，为dCas9而设计的gRNA也应是每个同源物特异的，而不能互相干扰。

Ma等人利用端粒序列特异的gRNA检验了dCas9变异体，发现不同荧光标记的dCas9可被引导到正确的目标序列。他们也能够利用针对9号和13号染色体的gRNA，来标记两对不同的染色体。

接着，他们将注意力转向染色体内位点的作图。这项技术成功分辨了物理距离为75和2 Mbp的位点，而它计算出的荧光距离与之前建立的物理图谱相关。在比较相距2 Mbp的目标时，他们发现能够评估如此短距离的染色质压缩程度。这也代表了染色体内位点的第一次作图。

未来应用

Ma等人是利用标准的荧光显微镜开发了这种方法，因此分辨率较低。这种方法与超分辨率显微镜的组合可提高分辨率，但背景信号是个问题。另一个需要注意的地方是它的灵敏度。作者预计至少要150-200个荧光蛋白分子，才能产生可检测的信号。一个可能的解决方案是SunTag，它可以招募多个蛋白分子。因此，细胞能够在较低的光照背景下成像，减少光漂白和光毒性的问题，并延长成像时间。

美国NIH已经启动了4D核组的研究计划，让研究人员合作了解染色质的结构。这种荧光CRISPR方法是基因组位点的活细胞成像上的一大进步。Ma等人预计，这种技术将适用于细胞周期进程的研究，以及细胞对外界刺激的反应。它还有望应用在癌症研究上，比如观察染色体易位或染色质碎裂。

原文检索

Multicolor CRISPR labeling of chromosomal loci in human cells. Ma H, Naseri A, Reyes-Gutierrez P, Wolfe SA, Zhang S, Pederson T. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 10;112(10):3002-7. doi: 10.1073/pnas.1420024112. Epub 2015 Feb 23. Pubmed.