研究循环肿瘤细胞的利器：流式细胞仪[创新技巧]

在一些癌症患者的血液中，人们发现了罕见的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）。这些细胞被认为以某种方式从恶性肿瘤释放到血液中。此外，它还可能参与了继发肿瘤形成的转移过程。

如此看来，CTC对癌症研究很重要。当然，它也是相当复杂。CTC通常是细胞角蛋白阳性（CK+）和CD45阴性（CD45-），但并非总是如此。在一些癌症中，上皮细胞粘附分子EpCAM存在于CTC表面，而另一些癌症却不是。CTC比淋巴细胞大，除了一些“小CTC”亚型。即使是来自同一位患者同一次抽血的样本，CTC也可能存在遗传异质性。

临床医生希望有一天CTC的液体活检分析能够取代侵入性的实体瘤活检。很显然，我们还需要深入了解这些复杂的细胞。此外，CTC在血液样本中的出现也有着预后的意义。CTC是癌症中的捣蛋鬼，它们的存在与预后不良有关。

CTC的罕见又使得研究极其困难。在一大堆有些相似的白细胞中，CTC的出现概率大概是百万分之一。即使是病人，常规抽血的样本中也只有10个或以下的CTC。了解这种高度复杂而又极其罕见的细胞，成为临床研究的目标。

流式分析

难怪研究人员一直将流式细胞仪作为CTC分析的工具。“流式细胞仪在从异质样本中寻找稀有细胞的能力是独一无二的，”BD生命科学的市场部经理Trent Colville谈道，“针对表面标志物的荧光标记抗体实现了CTC的鉴定。”

随着细胞通量的升高以及操作成本的降低，BD的FACSCanto II细胞分析系统及其他流式细胞仪正在解决这种大海捞针的挑战。多样化的流式检测技术正帮助研究人员揭开这些复杂细胞的奥秘。

Alison Allan等人探索了多参数流式细胞仪在这方面的应用，他们使用人乳腺癌的小鼠模型来模拟CTC分析的挑战1。作者发现，利用贝克曼库尔特XL-MCL流式细胞仪的前向散射能力可测定细胞大小，而三个荧光检测通道可测定HLA、CD45和非整倍体DNA内容，这有助于识别小鼠淋巴细胞中的人乳腺癌细胞。作者认为，通过去除CD45阳性的淋巴细胞，可初步富集CTC，增加实验的信息。

为了获得最佳的结果，CTC的样品制备和分析应当轻柔而快速。“CTC是稀有、脆弱，并对时间敏感的，”赛默飞世尔的高级工程师Mike Ward指出。“如果你能减少样品制备步骤，那么你分析CTC的机会将会提高。Attune NxT流式细胞仪的大样品量是个优势，让你不再需要通过离心或其他方式浓缩你的细胞，那样可能会造成细胞损失或伤害。”

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富集策略

事实上，任何CTC富集策略都需要将有CTC特征的细胞与没有这些特征的细胞分离，也存在CTC丢失的风险。为了减少这种风险，Tsvetana Hristozova等人开发出一种新的流式分析操作，以检测上皮癌CTC 2。他们以电子阈值操作来取代CD45+ 淋巴细胞的去除。

研究人员对BD的FACSCanto II流式细胞仪进行设置，以检测加在血液样本中的UT-SCC-23（鳞状细胞癌细胞），同时滤除细胞碎片引起的低前向散射信号，以及产生非CTC荧光图谱的细胞。结果表明，在数据采集过程中应用的电子阈值确实能省去CTC分析前的肿瘤细胞预富集。

之后，他们将这种方法应用在头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）患者的真实血液样本中，发现电子阈值操作检测到的CTC频率和数量与传统的免疫去除方法相当。作者的结论是，两种方法在分析SCCHN的CTC上同样有用，但阈值法更加经济，也更加省力。

在去年的美国癌症研究协会年会上，Amnis公司（默克密理博旗下）的科学家介绍了一种新方法。它利用多光谱成像以及Her-2和EpCAM的SmartFlare探针，这些靶定细胞内的RNA序列，而不是细胞表面蛋白。他们利用Amnis ImageStream MK II成像流式细胞仪来检测散发Her-2和EpCAM荧光信号的SKBR-3人乳腺癌细胞。

在白细胞过量10万倍的情况下，癌细胞的进一步鉴定是通过细胞大小和圆度分析来实现的。研究数据表明，这种成像流式细胞仪能够检测到十万分之一的肿瘤细胞。作者指出，在临床环境中，流式细胞仪所获得的细胞图像的分析可避免假阳性的发生。

流式细胞仪用于CTC分析的优点可不少。细胞的高速流动让研究人员能克服百万分之一的CTC发生率。样品运行的成本相对较低，而且市场上有各种荧光染料和仪器可以选择，让研究人员能自由地开展实验设计。不过，流式细胞仪是否会成为液体活检的主要平台，这还难以预测。

当然，随着人们不断开发出更先进的试剂和仪器，能够快速、详细地拷问流动的细胞，流式细胞仪在CTC分析上的优势将日益明显。

（作者：Matthew Wygant / 生物通编译）

参考文献

[1] Allan, AL, et al., “Detection and Quantification of Circulating Tumor Cells in Mouse Models of Human Breast Cancer Using Immunomagnetic Enrichment and Multiparameter Flow Cytometry,” Cytometry, 65A.1:4-14, 2005. [PubMedID: 15810015]

[2] Hristozova, T, et al., “A Simple Multicolor Flow Cytometry Protocol for Detection and Molecular Characterization of Circulating Tumor Cells in Epithelial Cancers,” Cytometry, 81A.6:489-495, 2012. [PubMedID: 22438318]