巧妙利用SNP来实现CRISPR编辑

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年8月25日 来源:生物通

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  北爱尔兰阿尔斯特大学的研究人员发现,SNP可能会带来野生型等位基因中没有的PAM。假如SNP对应于一个有害的等位基因,那么所产生的PAM可能为基于编辑的基因治疗提供了一个切入点。这项成果于上周发表在《Nature Gene Therapy》上。

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生物通报道 众所周知,CRISPR/Cas9基因组编辑经过设计,可靶定基因组的各个部分,当向导RNA与PAM上游的序列匹配,这种技术会带来双链断裂。对于基因组编辑中常用的Cas9酶,PAM的序列通常是NGG。

不过,北爱尔兰阿尔斯特大学的研究人员发现,SNP可能会带来野生型等位基因中没有的PAM。假如SNP对应于一个有害的等位基因,那么所产生的PAM可能为基于编辑的基因治疗提供了一个切入点。这项成果于上周发表在《Nature Gene Therapy》上。

在这篇文章中,研究人员挑选出KRT12基因,其中一个显性失活SNP导致了Meesmann角膜营养不良。这是一种家族性的疾病,婴儿期起病,进展缓慢,青年期症状明显。特征为不透明物积聚在角膜。L132P突变将“AAG”序列改变为“AGG”,满足了化脓性链球菌Cas9的PAM要求。

尽管CRISPR/Cas9编辑可导致两个不同的修复机制,但作者表示,任何一个都会带来成功干预。非同源末端连接(NHEJ)将导致移码突变,阻止此基因表达,而通过野生型模板的同源性定向修复也能成功。“两种结果都能被认为是治疗成功,”作者写道,并表示KRT12等位基因的破坏似乎不影响角膜完整性。

研究人员发现,他们可以通过这个新颖的PAM实现基因编辑。在小鼠模型中,他们证明了等位基因的体内编辑,其中13只小鼠中的5只测序后发现18至53个核苷酸的缺失。尽管这项研究主要集中在L132P突变,但作者认为许多SNP可创建新的PAM。

“显性失活错义突变可能导致一系列不同的角膜营养不良,我们的分析表明,高达三分之一的突变带来了新颖的PAM位点,这有望被CRISPR技术所使用,”文章的通讯作者之一、阿尔斯特大学的Andrew Nesbit谈道。

这种方法可能也适用于角膜营养不良以外的疾病。“对于一系列杂合的致病SNP,开发疗法的潜力存在,不管是利用NHEJ敲除突变等位基因,还是利用HDR修复突变等位基因,”作者写道。(生物通 薄荷)

原文检索

CRISPR/Cas9 DNA cleavage at SNP-derived PAM enables both in vitro and in vivo KRT12 mutation-specific targeting

Gene Therapy 20 August 2015; doi: 10.1038/gt.2015.82

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