用户名:

密 码:

测序 | miRNA | 表观遗传 | 蛋白研究 | 细胞研究 | 免疫学 | 转染 | PCR | qPCR | 核酸纯化 | 基因表达

您所在的位置:首页 > 新技术专栏

专家经验谈:如何减轻你的测序负担

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年8月26日 来源:生物通

摘要:

  芯片是目前临床上检测CNV的主要工具,但芯片检测在有些方面也是力不从心。举例来说,芯片只能帮助我们判断是否存在序列重复(或缺失),要获得更加全面的信息只能求助于二代测序(NGS)。NGS可以达到更高的分辨率,还能同时检出倒置、易位等其他结构异常,甚至为人们提供SNP和indel的信息。

分享到:
  

生物通报道:拷贝数变异CNV)是指基因拷贝数出现的异常,主要表现为基因组大片段的缺失和重复。CNV是基因组结构变异的重要组成部分,与自闭症、认知功能缺陷、癌症等多种疾病有关。芯片是目前临床上检测CNV的主要工具,但芯片检测在有些方面也是力不从心。举例来说,芯片只能帮助我们判断是否存在序列重复(或缺失),要获得更加全面的信息只能求助于二代测序(NGS)。NGS可以达到更高的分辨率,还能同时检出倒置、易位等其他结构异常,甚至为人们提供SNPindel的信息。

不过,为了检测CNV而测序整个基因组显然有些大材小用。不少研究者选择先富集自己感兴趣的序列再进行测序,比如只占基因组1%-3%的蛋白编码序列,或者与特定疾病有关的已知基因。这样的策略可以节省大量的人力、物力和成本,受到了广泛的欢迎。

CNV检测的老大哥

如果需要检测1Kb-3.5 Mb的染色体重复或缺失,研究者们一般选择使用芯片。芯片是一种经济实用的检测方法,非常准确而且覆盖度高,俄亥俄州立大学的助理教授Sameek Roychowdhury说。

不过芯片检测也有一定的局限,虽然芯片的分辨率高于G显带染色体分析(核型分析),但却检测不到染色体重排(比如倒置和易位),也无法鉴定插入或缺失位点。

NGS(不论是全基因组测序还是靶向基因组测序(比如全外显子组测序)),“我们付出的越多,收获也就越大。不论是全基因组测序还是靶向基因组测序(比如全外显子组测序),都可以获得SNPindel以及染色体结构重排的准确信息,”这都是芯片检测无法提供的,Roychowdhury说。

外显子组测序

坊间流传,随着测序成本的直线下降,靶向测序的吸引力会越来越小。对绝大多数应用而言,全基因组测序取代靶向测序只是时间问题。不过就目前来看,这一天离我们还有点儿远。我们在用NGS检测CNV的时候,仍然需要权衡不同方法的优劣,尽量减轻测序负担。

选择蛋白编码序列可以将人类基因组减少到35-70Mb,大约是整个人类基因组的2%85%的已知致病突变发生在这个被称为外显子组的区域。制备测序用的外显子组文库也并不困难,市面上有许多商业化试剂盒可供选择。

这些试剂盒大多以杂交为基础,在特异性探针杂交之后进行PCR扩增。安捷伦的SureSelect、罗氏的NimbleGen’s SeqCap以及IlluminaNextera都属于这类试剂盒,只是DNA片段化方法(超声法、酶处理等)或者探针指向的具体区域有所不同。这些试剂盒“对外显子组的定义是不同的,”瑞士心血管遗传学和基因诊断中心的Janine Meienberg博士说。她发现,没有哪个平台可以捕获所有已知的外显子,就算结合起来使用也做不到这一点。

还有一些试剂盒依赖于超多重PCR,将特异性的寡核苷酸作为PCR引物生成测序文库。这类试剂盒大多是用一套特别的引物获得PCR扩增版的外显子组,比如Thermo FisherIon AmpliSeq™。有的试剂盒使用分子倒置探针或锁式探针(比如安捷伦的HaloPlex),这种探针能结合在目的片段的末端形成一个环,而其余的基因组片段被消化。   

         可对任何基因进行靶向测序,Ion AmpliSeq Designer技术最新资料与报价>> >>

杂交法和多重PCR法各有优劣:杂交捕获难以处理重复和高GC含量的基因组区域,而多重PCR法更适合5Mb以下的靶标区域。有个研究团队发现杂交法会遗漏7%-10%的蛋白编码序列,于是开始把这两种方法结合起来使用。

Roychowdhury及其同事指出,不同外显子组富集平台在击中率、均一性和SNP检出方面存在差异,不过“这些方法检测拷贝数变异都比芯片有效”。

任何涉及扩增的技术都有可能出现偏好,这也是NGS检测CNV的一个潜在缺陷。数字PCR中的分液技术可以将多重化反应分成一个个单独的反应,实现更加均一的扩增,减少NGS检测中的偏好,Bio-Rad公司的Svilen Tzonev介绍道。

只测序你想要的

除了试剂盒以外,市面上还有一系列基于杂交或PCR的靶向富集panel。这种产品旨在帮助人们检测一组特定的基因,比如与某种癌症有关的基因。用户们还可以使用厂家提供的设计软件,根据自己感兴趣的基因建立自定义panel

最近,安捷伦发布了一体化的靶向序列捕获产品OneSeq。该产品结合了外显子富集所用的宽间隔探针与SNP芯片中密集的靶向性探针。OneSeq和安捷伦的免费软件SureCall相结合,可以整合拷贝数变异、SNPindel以及杂合性缺失的数据分析。

                                                                          免费索取安捷伦OneSeq产品的更多信息 

芯片、外显子组测序和靶向性panel都是CNV检测的实用技术,正可谓条条大路通罗马。但对于探索性研究而言,“我们更倾向于全基因组测序,以便发现新的事物,”华盛顿大学的助理教授Vincent Magrini说。

参考文献:

 [1] Martin, CL, Warburton, D, “Detection of chromosomal aberrations in clinical practice: From karyotype to genome sequence,” Annu Rev Genomics Hum Genet, 2015. [PubMed ID: 26077817]

[2] Meienberg, J, et al., “New insights into the performance of human whole-exome capture platforms,” Nucleic Acids Res, 43:e76, 2015. [PubMed ID: 25820422]

[3] Miya, F, et al., “A combination of targeted enrichment methodologies for whole-exome sequencing reveals novel pathogenic mutations,” Sci Rep, 5: 9331, 2015. [PubMed ID: 25786579]

[4] Samorodnitsky, E, et al., “Evaluation of Hybridization Capture Versus Amplicon-Based Methods for Whole-Exome Sequencing,” Hum Mutat, 2015. [PubMed ID: 26110913]

 

生物通编辑:叶予

(http://www.ebiotrade.com/)
版权所有,未经书面许可,不得转载

我来说两句(0)

[Ctrl+Enter]

加载读者评论......

相关文章:

    加载相关文章......

今日文章:

    加载今日文章......
    加载中......
    加载中......

技术期刊

GE期刊 | 基因快讯

    加载中......
    加载中......

更多>>

技术大讲堂

分子 | 细胞 | 蛋白 | 其它

    加载中......
    加载中......
    加载中......
    加载中......

更多>>

特价专栏

    加载中......

更多>>

会展信息

    加载中......

更多>>

生物通首页 | 生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 生物直通车 | 科研交流 | 正牌代理商 | 中国科学人 | 新技术专栏 | 技术讲座

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号