新方案 | 环状RNA研究就要这么做！

有联川circRNA系统解决方案，circRNA，你想辣么玩就辣么玩！

谁说RNA都是线性的

在2013年《自然》杂志上，发表了两篇重要的研究论文揭示出一些非编码的环状RNA（circular RNAs，circRNA）充当分子“海绵”，结合并封闭了microRNAs，进而调控基因的表达。研究人员推测circRNA还具有许多其他的功能。其中一篇Nature文章的作者甚至说，这些分子构成了一个“隐秘的未知RNAs平行宇宙”。

 
图1 circRNA生源机制

这个重要发现再次提醒人们：RNA并不仅仅是DNA与编码蛋白之间的一个平凡信使。在过去的20年里，研究人员发现了大量的非常规RNA。一些长度意想不到的短，如microRNA，一些则长到令人感到惊讶，如lncRNA，而另一些则颠覆常规具有阻止其他RNA链翻译形成蛋白质的功能。但是一直以来人们都认为几乎所有的RNA都是线性的，为数不多的关于环状RNAs的记述，也仅被当做遗传意外或实验人为因素而遭到忽视。

为什么之前没发现circRNAs

实际上，线性RNAs的优势有可能一直是假象。经典的RNA测序方法只能分离具有特征性分子“尾巴“的那些分子（即polyA+序列）。环状RNAs的末端连接在一起，缺乏这些尾巴，因此在测序文库制备中被普遍忽略掉。

 
图2 传统RNA-Seq文库制备过程

然而，随着测序技术的进步，研究人员累积了大量的RNA序列数据集，其中一些来自无尾巴的RNA（polyA-序列）。斯坦福大学医学院研究小组就报道了他们在寻找用传统方法可能忽视的RNA过程中，发现了大量的环状人类RNAs。另一个课题组也在挖掘环状RNA分子的数据库时，在线虫、小鼠和人类中发现了成千上万的环状RNAs。

大头儿子的大头是由circRNA说了算
 
科学家们发现，哺乳类动物大头的发育基础之一，依赖一种被称为miR-7的分子，如果没有它在关键时刻抑制某些基因的表达，哺乳类动物就无法得到它们赖以称霸世界的智力。在实验室中把正在发育的大脑皮层中的这类RNA干掉，你就会得到一只小头老鼠。那么哺乳类动物的身体是如何控制这一过程，以获得大小合适的头颅？谁来控制这些microRNA的功能呢？让科学家们大吃一惊的是，生命系统使用了另外一类独特的RNA—circRNAs。研究人员将焦点集中在一个由大约1500个核苷酸构成的环状大RNA上，它表达于小鼠和人类的大脑中。研究人员发现该circRNA包含了70个miR-7的结合位点。它的表达阻断了miR-7，使得miR-7活性受到抑制，进而解除了该miR对其靶基因的抑制作用，靶基因表达出现上升。另一项研究证实，在斑马鱼中表达该circRNA或敲除miR-7可以改变大脑发育。研究发现，circRNA可以像海绵吸水一样，吸附细胞中出现的microRNA。

 
图3 circRNA与miR-7的互作机制

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circRNA居然不易被降解

与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。circRNA由特殊的选择性剪切产生，大多数存在于真核细胞的细胞质中，序列高度保守，具有一定的组织、时序和疾病特异性。许多circRNAs的表达水平与线性RNA的表达水平相当甚或更高。这些特征和最近的研究都表明，circRNAs有巨大潜力成为新的疾病诊断标志物。

 
图4 circRNA不被RNA外切酶降解

circRNA和ceRNA是啥关系？

ceRNA（competing endogenous RNA）是由美国哈佛大学医学院的研究小组于2011年在《细胞》上提出的一项假说，其核心内容：具有相同miRNA应答元件（MiRNA Response Element，MRE) 的mRNA、假基因转录物、lncRNA等转录物通过竞争性结合同种miRNA来调控各自的表达水平，从而影响细胞的功能。近年来多项研究已证实了该假说的真实性。所以，ceRNA并不是一类RNA分子，而是一个假说，一种调控机制。

circRNA（circular RNA, 环状RNA）是一类通常由一个以上外显子构成的环形RNA分子。circRNA具有如下特征：(1)大多数定位于细胞质, 且序列高度保守；(2) circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，比线性RNA更稳定, 不易被降解; (3)许多circRNA表达水平与线性RNA的表达水平相当, 一些circRNA的表达水平甚至超过它们的线性异构体10倍; (4)大多数来自蛋白质编码基因的外显子; (5)一些circRNA拥有 MRE，能与miRNA相互作用; (6)大部分是非编码RNA。

circRNA是一类高效的ceRNA

circRNA的上述特征使其具备了成为一类高效ceRNA的可能性。几种ceRNA分子间通过竞争性结合共同的miRNA来相互调控各自的表达水平, 从而实现基因表达调控的作用。位于细胞质中的circRNA具有结构较稳定、高丰度表达的特征, 这使它们能发挥ceRNA功能, 较持久、迅速地调控miRNA水平。

 
图5 circRNA，miRNA，lncRNA，mRNA相互间的ceRNA调控网络

circRNA不仅仅是ceRNA

许多circRNA的表达具有时空特异性, 这暗示circRNA可能具有多种生物学功能。除了与miRNA相互作用外，circRNA至少还可能具有以下3种功能： (1)circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平（图6B）；(2)circRNA能与蛋白质结合, 抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性（图6C）；(3)一些circRNA可作为翻译的模板指导蛋白质的合成（图6D）。

 
图6 circRNA具有的主要功能

circRNA前途不可限量

circRNA独特的特征和多样的功能, 使它们在生命科学和医学中具有广阔的应用前景: （1）circRNA作为稳定高效的miRNA抑制剂；（2）circRNA用于稳定地调控RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）的活性；（3）circRNA作为稳定的蛋白质合成模板；（4）circRNA应用于RNA干扰；（5）circRNA作为适配体（aptamer）用于高效地结合特定靶标；（6）circRNA作为生物标志物用于疾病诊断及易感性分析。

circRNA研究系统解决方案

联川生物科研团队针对circRNA研究的特点，依托多年丰富的非编码RNA科研项目经验，为研究人员精心设计了从circRNA发掘到circRNA的ceRNA调控机制探析的一整套系统解决方案。

 

circRNA研究代表案例

案例一：整合分析mRNA-miRNA-circRNA测序数据揭示化学物致癌新观点

本研究以人类HepG2细胞为对象，利用高通量测序技术分析BaP作用过程中的致癌机制。整合mRNA、circRNA、miRNA测序数据（设置6个时间点），时序分析Bap处理对基因表达的影响。时序实验发现miR-181a-1_3p随着时间变化表达一直下调。作者以其为研究对象，寻找在BaP作用下的调控机制。靶基因预测发现，有14个差异表达mRNA（包括DNA修复基因MGMT）和16个差异表达的circRNA具有miR-181a-1_3p的作用位点。数据分析发现，随着时间的变化，miR-181a-1_3p、MGMT和cirRNA具有一定的表达相关性。作者推测：在BaP作用下，会超量表达miR-181a-1_3p，从而抑制MGMT的翻译，抑制DNA损伤修复；随着时间的增加，circRNA的表达量增加，竞争性结合miR-181a-1_3p，从而解放MGMT，一定程度上对DNA损伤进行修复。

 
图1 miRNA，mRNA和circRNA之间推测的ceRNA竞争关系

案例二：神经环状RNA在发育期间调控突触功能

最近，研究人员采用去除核糖体的RNA进行深度测序，并结合计算工具，已从古生菌到人类等生物中发现了成千上万条新的环状RNA（circRNAs）。实验证实，一些circRNAs可以作为”海绵”吸附miRNAs，从而阻止miRNAs与其靶基因的相互作用。circRNA也可以吸附RNA结合蛋白（RBPs），进而调控细胞内相关RBPs或RNAs的运输。尽管在神经元中已鉴定到其他种类的RNA（如miRNA，lncRNA）和基于RNA的调控模式，但却少有circRNAs的研究。

本研究发现，circRNAs大量富集于脑，来自于编码突触蛋白的宿主基因（图1）。高分辨率的原位杂交显示，circRNAs主要位于神经元树突（图2）。实验证实了circRNAs在发育过程中调控突触功能，许多circRNAs会在突触发生时突然地改变它们的丰度（图3）。此外，在神经活性自身稳态下降后，许多circRNAs表现出明显的上调或下调（图4）。在本研究中，未发现脑circRNAs可以结合miRNAs和RBPs，或是翻译出蛋白。

 
图1 不同组织中的circRNAs表达谱，揭示circRNAs富集于脑

a. 实验与分析流程，b. circRNAs的旋转环形cDNA产物，c. 不同组织中环形测序数据占可比对基因组的测序数据的比例，d. 不同组织中产生circRNAs的基因占所有表达基因的比例，e. 不同组织中只在一种组织中表达的circRNA宿主基因的数量，f. 脑相比于其他组织，宿主基因位点上circRNAs与总转录物的丰度比例。

 
图2 脑表达的circRNAs来自编码突触蛋白的基因并富集于突触组织

 
图3 脑circRNAs在发育过程中的表达谱变化

 
图4 circRNAs受到自身稳态可塑性的调控

案例三：鉴定植物中广泛存在的非编码环状RNA

本研究以水稻和拟南芥为研究对象，进行了全基因组范围circRNA的鉴定，并对其特性进行了分析。通过对水稻和拟南芥的RNA seq数据进行参考基因组比对和过滤，判断原始reads是否存在circRNA splicing，最后在水稻中鉴定到12,037个circRNA，在拟南芥中鉴定到6,012个circRNA。数据分析发现，有700个外显子circRNA的亲本基因在水稻和拟南芥中为直系同源基因，表明植物中的circRNA具有较强的保守性。植物circRNA表现出不同的表达模式，27个外显子circRNAs在磷酸盐胁迫下出现差异表达。同时发现，一些circRNA与亲本基因的表达谱表现出显著正相关。

 
图1 植物环状RNA特征

参考文献
1. Memczak S, et al. (2013) Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatorypotency. Nature 495(7441):333-8.
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5. Leonardo Salmena, Laura Poliseno, Yvonne Tay, Lev Kats, Pier Paolo Pandolfi. (2011) A ceRNA Hypothesis: The Rosetta Stone of a Hidden RNA Language? Cell, 146(3): 353-358.
6. Xia Tian, Jiang Xiaoming, Chen Xiaomin et al. (2013) Circular RNA: A New Member of Competing Endogenous RNAs. Chinese Journal of Cell Biology, 35(11):1695–1700.
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8. You X, et al. (2015) Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity. Nat Neurosci, 18(4):603-10.
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