Nature Methods:两篇文章聚焦tRNA测序

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年9月2日 来源:生物通

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  高通量RNA测序(RNA-seq)技术的使用让我们认识了细胞中无比精彩的RNA世界。然而,目前的方法无法检测高度修饰或大量折叠的RNA,如tRNA。近日,《Nature Methods》上的两种方法通过在文库制备前去除tRNA的修饰,解决了tRNA测序的技术难题。

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生物通报道 高通量RNA测序(RNA-seq)技术的使用让我们认识了细胞中无比精彩的RNA世界。然而,目前的方法无法检测高度修饰或大量折叠的RNA,如tRNA。近日,《Nature Methods》上的两种方法通过在文库制备前去除tRNA的修饰,解决了tRNA测序的技术难题。

尽管tRNA被认为是看家RNA,但最近的研究表明,tRNA受到严格调控。tRNA表达模式的差异让增殖和分化细胞表达出不同的翻译程序。此外,tRNA也能被切割成更小的RNA,其中一些参与了细胞增殖,甚至比microRNA更丰富。这些成果都说明,我们需要更好地了解tRNA如何被调控。

传统的RNA-seq方法大家都清楚,就是在RNA的末端加上接头,再利用与3’端接头互补的引物进行逆转录。这种方法适用于大多数转录本,但tRNA是个例外。因为成熟的tRNA都采用紧凑的三级结构,限制了接头连接和cDNA合成的效率。其次,每个tRNA上平均有8个或更多的核苷酸是翻译后修饰的,以确保正确的tRNA折叠。这些包括所谓的“hard-stop”修饰,阻止逆转录酶的延伸。因此,传统的方法不再适用。

为了突破这个障碍,两个研究小组使用大肠杆菌的脱烷基化酶AlkB,去除tRNA中m1A和m3C上的甲基,将其转化成未经修饰的形式。芝加哥大学的Guanqun Zheng等人还利用突变的酶来处理m1G。通过野生型和突变AlkB的处理,>70%的m1A、m3C和m1G上的甲基化被去除。当然,还有一些hard-stop修饰无法去除。

之后,芝加哥大学的研究小组利用一种热稳定的逆转录酶(TGIRT)来代替普通的逆转录酶。这种酶是高度进行性的,通过模板转换的机制来合成cDNA,从而省去了接头连接的步骤。他们发现,未经处理的tRNA会带来截短的测序读取,而AlkB处理明显增加了全长cDNA的量,让他们可定量和区分tRNA。

第二个研究小组则开发出一种称为ARM-seq的方法。与第一种方法不同,这种方法需要在成熟RNA的两端添上接头。它不如模板转换高效,但确保只有全长的转录本(成熟的tRNA、tRNA前体和tRNA衍生的小RNA)才被PCR扩增和测序。ARM-seq能够准确捕获已知的修饰位点,并鉴定出tRNA中的新位点。

这两种方法让我们能够全面监控tRNA的水平,并捕捉核苷酸修饰的动态。也许,它们还能应用在之前未发现的其他转录本的hard-stop修饰上,包括mRNA和非编码RNA。(生物通 薄荷)

原文检索

Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing
Nature Methods 12, 835–837 (2015) doi:10.1038/nmeth.3478

ARM-seq: AlkB-facilitated RNA methylation sequencing reveals a complex landscape of modified tRNA fragments
Nature Methods 12, 879–884 (2015) doi:10.1038/nmeth.3508

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