如何避开基因克隆中的重重陷阱？[创新技巧]

在过去三十多年，克隆基因的需求一直在不断增长。人们已经有了很多经验，但还是遇到了一些困难。传统的连接克隆看似很简单，但也有不少陷阱，如何避免？美国罗林斯研究中心、埃默里大学医学院的Ichiro Matsumura在新一期的《BioTechniques》杂志上分享了他的经验。

在过去三十多年，克隆基因的需求一直在不断增长。人们已经有了很多经验，但还是遇到了一些困难。传统的连接克隆看似很简单，但也有不少陷阱，如何避免？美国罗林斯研究中心（Rollins Research Center）、埃默里大学医学院的Ichiro Matsumura在新一期的《BioTechniques》杂志上分享了他的经验。

将DNA整合到载体上，随后用重组产物来转化微生物，这个过程看似很简单。技术的不断细化、替代方法的开发、克隆试剂盒的商业化，以及外包实验室的出现，为用户提供了多个选择。然而，多样化的选择未必是好事，因为开发者总在宣称，他们的方法更快、更方便、更高效，而往往使研究人员感到困惑。

Matsumura认为，研究的固定成本，特别是高收入国家的劳动力成本，远远高于分子克隆中所使用的试剂成本，因此没有什么比实验失败和重复更加昂贵。在他看来，提高克隆效率的最有效方法是使用那些容易理解、找出问题所在的技术，以便最大程度减少重复。在此，他一一回顾了克隆反应所使用的酶、底物以及试剂，便于研究人员排查故障。

琼脂糖电泳

在克隆过程中，PCR产物和载体都需要经过酶切，然后连接并转化大肠杆菌。这个过程可通过琼脂糖凝胶电泳来监控。作者认为，质粒和PCR产物应在纯化前后跑胶，并在酶切后、凝胶纯化后以及连接后跑胶，这样克隆过程的每一步都能得到确认。有经验的研究人员可以及时解决问题，或尽早终止实验。

（图片来自BioTechniques）

硅胶膜纯化

载体经过酶切后，需要经过凝胶纯化，以提高克隆效率。然而，切胶的过程对技术要求高，也很难自动化，而且DNA暴露在紫外光下会大大降低转化效率。凝胶纯化的产量往往有限，因此研究人员需要消化毫克级的DNA，才能产生最后的终产物。不过，大多数研究人员仍选择这种方法，因为它们比较容易上手。

作者也提到，残留的琼脂糖，或凝胶提取过程中引入的各种溶剂和盐，可能抑制T4连接酶的活性，从而降低克隆效率。这些物质难以检测，因此通常被认为是“已知的未知数”，而连接是否高效，要通过琼脂糖凝胶电泳来确认。

聚合酶

热稳定的DNA聚合酶让PCR成为可能，但也使后面的克隆步骤复杂化。与Taq DNA聚合酶相比，新上市的聚合酶也许更准确、更快速，也更稳定，但作者认为，这对克隆而言并不是件好事。Taq/DNA复合物的解离常数是20 nM，与扩增产物的终浓度相当，因此酶往往与扩增产物同时纯化。另外，改造后的DNA聚合酶热稳定性更高，在有机溶剂和离液盐中的构象稳定性也更高，因此使得PCR产物的纯化更加困难。

限制性内切酶

限制性内切酶的出现是为了保护细菌免受噬菌体及其他入侵者。因此，限制性内切酶/DNA底物的KM值相当低。人们有时会尽量提高酶切反应中DNA的浓度，这样凝胶纯化的产物才足够连接反应使用。然而，在这种情况下，限制性内切酶会受到抑制，从而导致不完全的消化。这使得克隆后出现高背景，而需要花大力气来筛选。

T4连接酶

连接反应失败的原因有很多，但失败可能在加入T4 DNA连接酶之前就发生了：DNA末端不均一、酶切不完全、连接酶抑制剂，或突出的部分被补平。在某些情况下，连接反应失败可能是因为缓冲液中的ATP浓度过低，或酶可能变性。T4连接酶在室温下相当稳定，但被水稀释后可不是。如果有问题，可以通过阳性对照来检测酶的完整性。

感受态细胞

大家都知道，在克隆过程中，感受态细胞至关重要。即使之前的分子克隆效率不高，但高效转化能够给予补偿。目前有两种最常见的转化方法，热激转化和电穿孔。作者提到，电穿孔是最有效的，更重要的是，转化细胞的数量与DNA的量成正比。他认为，对于困难的克隆项目，电穿孔无疑是首选方法。化学转化的效率不及电穿孔，而且会因DNA过量而抑制。不过，因为比较方便，所以更多地被采用。

作者也点评了一些新的克隆技术，比如TA克隆和不依赖连接的克隆（LIC）。尽管有些技术声称更快、更方便、更高效，但有经验的科学家会怀疑他们没有测试或透露方法的局限性。没有一种DNA纯化技术或酶催化反应是100%有效或特异的，特别是在不太理想的情况下，因此，最容易监控和排查的技术往往是最可靠的。（生物通 余亮）

原文检索

Why Johnny can't clone: Common pitfalls and not so common solutions

BioTechniques, Vol. 59, No. 3, September 2015, pp. IV–XIII