纳米孔测序的过去、现在和将来

生物通报道：纵观测序技术的发展历程，没有哪一个技术像纳米孔测序那样慢热，但也没有哪一个技术像纳米孔测序这么接近普罗大众。将单链DNA拉过蛋白孔，检测碱基穿过时电导的微小改变，纳米孔测序的这一基础理念已经有十几年历史了。

1996年哈佛大学的Daniel Branton、加州大学的David Deamer及其同事，在美国国家科学院院刊PNAS杂志上首次发表文章指出，可以用膜通道检测多核苷酸序列。然而从第一篇论文到纳米孔测序的成形，这条道路并不是一帆风顺的。研究者们产生了很多分歧，也遇到了大量的技术死胡同。

一个平凡的开始

利用纳米孔进行测序的理念是非常直观的：让DNA碱基一个个穿过纳米孔，同时快速鉴定每一个碱基。然而真正实施起来人们却遇到了很多问题。如何在碱基穿过的时候进行检测？DNA链穿过纳米孔时是否需要放慢速度？如何大量生成同样大小的纳米孔？

Deamer和Branton最初的想法是，给持续开启的通道施加跨膜电压，把线性DNA或RNA链拉过纳米孔。这一过程会立刻改变纳米孔的离子流，对此加以检测就可以确定DNA或RNA的构成。然而，在这种情况下DNA穿过纳米孔的速度太快，难以进行有效检测。

进入二十一世纪之后，越来越多的研究者致力于解决这些问题，让纳米孔测序成为现实。“可以说是NIH的$1000基因组计划刺激了纳米孔测序的发展，” Oxford Nanpore公司的创始人之一，牛津大学的Hagan Bayley最近撰文指出。

人们开始尝试改良纳米孔本身。天然的生物学通道（比如alpha-hemolysin）和开口小于2nm的人工纳米孔都可以用于纳米孔测序。研究者们发现，虽然人工纳米孔免去了和生物学材料打交道的麻烦，但大规模制造这么小的纳米孔实在太困难。最终，蛋白通道成为了纳米孔测序的主流。

真正实现商业化

2005年，Bayley、Gordon Sanghera和Spike Wilcocks创立的Oxford Nanopore公司正式登场。为了开发稳定可靠的纳米孔测序平台，该公司从2007年开始研发以蛋白为基础的纳米孔测序系统。2012年，该公司在AGBT(基因组生物学技术进展年会)上发布了自己的纳米孔系统——MinION。

MinION是首个U盘大小的纳米孔测序仪，价格在一千美元作用，一天能生成约1Gb数据。该系统发布之后很快引起了轰动，被许多人视为基因组测序的未来。然而直到2014年的AGBT，人们才首次看到MinION系统的实战表现。

Broad研究所的David Jaffe在这次会议上展示了自己的MinION数据，他利用纳米孔测序的长读取来组装细菌基因组。研究显示，这个平台的平均读长大约在5kb左右，最长能达到20kb。对于这么小的装置来说，这种测序能力是相当令人震撼的。虽然MinION的总体序列质量和错误率受到了一些质疑，但仍然有很多研究者希望尝试这种迷你测序仪。

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这一次，人们并没有等太久。2014年Oxford Nanopore公司启动了先期体验项目，研究者只需要提供一千美元的押金和相应的运费，就可以获得测序设备和一次性的流动槽，在自己的项目中尝试MinION系统。

2015年初，先期体验项目的数据陆续发布出来。三月份，Exeter大学的研究人员在Biomolecular Detection and Quantification杂志上发表文章，对MinION系统性能进行了评估。文章写到“作为首个基于纳米孔的商业化单分子测序仪，MinION是很有前景的。然而，目前的错误率限制了它与现有测序技术竞争的能力。不过我们发现，MinION与Illumina MiSeq数据结合起来使用，有助于de novo基因组装配。”

七月份，一个瑞典研究团队用MinION建立了细菌基因组草图。研究表明，这一系统生成了能定位的长读取，精确度达到79%。作者们总结道，“随着进一步的技术发展，我们相信MinION不仅可用于基因组装配，也能用于实地的快速检测。”此外，还有研究者用MinION对绿脓杆菌和大肠杆菌E.coli进行了测序。（延伸阅读：Nature：掌上测序仪表现令人惊艳）

高通量就在前方

纳米孔测序目前还处于发展初期。除了解决错误率问题，平行测序能力对于这一技术的推广也很重要。问题是，怎样才能同时评估成千上万个纳米孔的离子流改变。

八月份，Hagan Bayley和牛津大学的研究人员在这方面取得了突破性进展。他们开发的光传感纳米孔芯片，能够同时检测大量的纳米孔。检测方法的改变是这项研究的关键所在。Bayley等人将纳米孔的离子流变化转化为可以直接观测到的荧光改变，并在多种蛋白纳米孔（包括alpha-hemolysin）中展示了这一技术的可行性。这一技术为大规模纳米孔测序平台奠定了基础。

参考文献：

1. Kasianowicz J.J., Brandin, E., Branton, D., and Deamer, D.W. 1996. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93(24): 13770-13773.

2. Laver, T. et al. 2015. Assessing the performance of the Oxford Nanopore Technologies MinION. Biomolecular Detection and Quantification, Vol 3, pg 1-8.

3. Karlsson, A et al. 2015. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing. Scientific Reports, doi: 10.138/srep11996

4. Huang S. et al. 2015. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. doi: 10.1038/nnano.2015.189

 

生物通编辑：叶予