北大鲁凤民教授：用CRISPR/Cas9治疗乙肝

　　

s生物通报道   来自北京大学的研究人员报道称，他们用双gRNAs导向CRISPR/Cas9系统抑制了乙型肝炎病毒复制。这项研究发布在近期的《World J Gastroenterol》杂志上。

论文的通讯作者是北京大学医学部病原生物学系鲁凤民（Feng-Min Lu）教授。其主要从事病毒性肝炎的实验室诊断、HBV感染相关肝癌发病机制等研究。在病毒性肝炎研究方面曾获国家科技进步二等奖一次。在包括New England Journal of Medicine、Cancer Research、American Journal of Human Genetics、Cancer Cell等杂志共发表SCI收录研究论文约50篇。

尽管可获得预防性疫苗，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球一个重要的公共健康问题。由于HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)储存库持续存在于肝细胞的细胞核中，当前的抗病毒药物，包括核苷类似物(NAs)和干扰素(IFN)都只能控制HBV生成，却无法清除HBV。NAs不能影响cccDNA，因此停止抗病毒治疗的患者乙肝常常会再度复发。此外，由于HBV cccDNA的稳定性非常高而降解缓慢，因此需要终身治疗慢性乙肝。另一方面，虽然在胞嘧啶脱氨和脱嘌呤/无嘧啶位点形成后IFN-α可以降解cccDNA，并进一步清除某些患者体内的病毒，其疗效尚不能令人满意。除去cccDNA是临床治愈慢性乙肝的唯一途径，也是慢性乙型治疗中一个仍有待解决的问题。

CRISPR/Cas9系统是源自细菌和古细菌适应性免疫系统的一种新型基因组编辑工具（延伸阅读：顾臻博士权威期刊：开发CRISPR-Cas9新型载体 ）。CRISPR/Cas9系统可诱导靶基因组位点发生双链断裂(DSB)来促进基因组编辑。在缺乏修复模板时，DSBs是通过非同源末端连接(NHEJ)过程重新连接，这可以导致插入/缺失(indel)突变。研究人员已不仅成功应用CRISPR/Cas9系统在细胞中实现基因组编辑，还利用其破坏了病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因组。就HBV来说，研究证实CRISPR/Cas9系统可以有效切割HBV A和D基因型的表达模板，A, B, C, D基因型是东亚及世界其他地区HBV主要的基因型，因此必须要设计出HBV A-D基因型特异性的向导RNAs (gRNAs)。

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在这篇文章中研究人员评估了CRISPR/Cas9系统清除HBV A-D基因型的基因组的潜力。他们总共设计出了对抗HBV A-D基因型的15种gRNAs。选出了覆盖HBV调控区域的11个双gRNAs组合。通过测量HBV表面抗原(HBsAg)或培养物上清液中的E抗原(HBeAg)检测了每种gRNA和11个双gRNAs抑制HBV（A-D基因型）复制的效力。利用PCR和测序方法检测了在共转染双gRNAs和HBV表达载体的HuH7细胞中HBV表达载体的破坏情况。并利用KCl沉淀、PSAD消化、滚环扩增结合定量PCR的方法在HepAD38细胞中检测了cccDNA的破坏情况。并评估了这些gRNAs的细胞毒性。

结果显示所有gRNAs都可以显著减少培养物上清液中HBsAg或HBeAg生成，这取决于gRNA对抗的区域。所有的双gRNAs都可以有效的抑制HBV A-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，与单gRNA相比，双gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。此外，通过PCR直接测序技术，他们证实了这些双gRNAs可通过除去两gRNAs切割位点之间的片段来破坏HBV表达模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12组合不仅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，还能够破坏HepAD38细胞中的cccDNA储存库。

这些结果表明了，CRISPR/Cas9系统可以有效破坏HBV表达模板，且没有明显的细胞毒性。它有可能是在慢性HBV感染患者中根除持续存在的HBV cccDNA的一种潜在的方法。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication

Despite prophylactic vaccines available for many years, hepatitis B virus (HBV) infection remains an important public health problem worldwide. Current antiviral agents, including nucleos(t)ide analogues (NAs) and interferon (IFN), can control HBV production but not eliminate HBV……

作者简介：

鲁凤民

男，1963年出生。现任北京大学医学部病原生物学系教授、博士生导师、学系常务副主任。1986年毕业于河南医科大学临床医学专业；1989年、1992年于哈尔滨医科大学分别获医学遗传学硕士学位和医学博士学位；1992~1994年在北京大学医学部公共卫生与预防医学博士后流动站做博士后研究，指导教师庄辉院士；1994~1997年在北医三院中心实验室工作。1997~2005年先后留学瑞典Karolinska医学院、美国宾夕法尼亚大学等。2006年至今回国任教北京大学医学部。现任中国生物技术协会实验室生物安全专业委员会常委、北京市微生物学会常委、国家病原微生物卫生应急实验室网络专家委员会委员。兼任《生物学通报》、《中国病毒病杂志》、《中国输血杂志》等多个学术期刊常务编委或编委。曾作为学术秘书，全程参与了国家中长期科技发展规划“艾滋病和病毒性肝炎防治重大专项”《病毒性肝炎领域项目》的实施方案编写和论证工作。

主要从事病毒性肝炎的实验室诊断、HBV感染相关肝癌发病机制等研究。作为课题负责人承担的课题有“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项“十一五” I期课题“乙型和丙型病毒性肝炎诊断及临床监测的研究”、 “十二五” 课题 “乙型病毒性肝炎临床诊断及监测技术的研究”；北京市科技计划“病毒性肝炎防治关键技术研究”课题；国家自然科学基金面上项目“HBx通过激活ERKs影响细胞周期素D1蛋白质转移”； 以及“863”、“973”计划等。 在病毒性肝炎研究方面曾获国家科技进步二等奖一次。在包括New England Journal of Medicine、Cancer Research、American Journal of Human Genetics、Cancer Cell等杂志共发表SCI收录研究论文约50篇，中文论文50余篇。