Nature Biotechnology：利用CRISPR筛查人类基因组“垃圾”DNA

　　

生物通报道  在几个研究小组正致力将CRISPR/Cas9系统应用于临床的同时，另一些研究团队则在利用这一工具来解决有关生物学的基础问题。近期，荷兰癌症研究所遗传学教授Reuven Agami与和同事们应用CRISPR搜寻了整个基因组中的调控增强子元件（延伸阅读：Nature发布突破性CRISPR-Cas9新技术 ）。

他们将Cas9核酸酶靶向了从前鉴别出的两个转录因子p53与雌激素受体α(ERα)的增强子元件——这些转录因子结合DNA序列远距离调控了基因表达。在癌症中p53和Erα频繁发生突变及失调控。这一小组发表在1月11日《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上的研究结果，阐明了两种蛋白的关键增强子序列，证实了CRISPR在系统研究非编码DNA序列中的实用性。

Fred Hutchinson癌症研究中心的Cecilia Moens（未参与该研究）说，以往其他的两个研究小组曾利用CRISPR构建出了可用于功能性遗传筛查的人类细胞蛋白质编码基因敲除文库。但当前的研究是第一次利用CRISPR/Cas9系统对调控元件进行了遗传筛查。“这是一项概念证明研究。”

迈阿密大学医学院的Ramin Shiekhattar（未参与该研究）说：“由于在内源性环境中，不利用报告基因分析极难评估调控元件的功能，这种基于CRISPR的方法真的有必要。”

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许多蛋白质编码基因突变已知促进了癌症生长。寻找影响癌症生长的非编码区域突变则一直是一项挑战。

Agami说：“增强子正确发挥功能对于维持健康组织至关重要，有许多迹象表明在癌症中增强子功能失常有可能导致了支持肿瘤发生发展的基因表达改变。我们需要一种工具来精确描绘出哪些增强子有可能在癌症中起重要作用，因为识别肿瘤中的一种非编码突变是这种肿瘤生长的原因还是结果是件非常难的事。”

Agami研究小组构建出了靶向685个基因组位点（代表了90%的p53已知增强子元件）的一个CRISPR单导向RNA文库。除了这一单导向RNA，用于筛查的人类细胞还表达了p53与一种可诱导癌基因Hras。诱导Hras异常表达可导致p53介导的细胞衰老。但如果研究小组利用CRISPR敲除对p53功能至关重要的一个增强子，Hras表达能使细胞继续无限制地生长。通过这种方式，该研究小组鉴别出了3个对p53功能极为重要的增强子元件，其中两个就在p21 （也称作CDKN1A）基因的上游。显然，p53需要结合p21基因上游这两个位点才能充分激活细胞衰老。

在第二项筛查中，研究人员构建出了靶向73个Erα增强子结合位点的一个不同的单导向RNA文库。在依赖于Erα表达实现生长的人类乳腺癌细胞系中，他们鉴别出了三个增强子序列。

Broad研究所遗传干扰平台主任David Root（未参与该研究）说：“看到这种策略起作用令人感到兴奋。接下来，了解这一方法的广泛性将会非常有用。”

将Erα活性必需的DNA元件进行分类后，Agami研究小组计划在对抗雌激素治疗产生耐药的乳腺癌患者肿瘤样本中测序这些位点。“我们想知道肿瘤样本是否在这些增强子元件中累积了突变，这或许可以解释肿瘤对治疗产生耐药的原因。”

Shiekhattar说，当前研究的一个有用的扩展点是，在特定情况下——如在发育的一些精确时间点及特异肿瘤类型中检测活化的增强子。“我们无法用组织培养物完全重演出体内发生的事件。现在我们可以在小鼠模型中利用CRISPR。”

Moens说：“对于我们来说，CRISPR/Cas9让靶向突变变得非常简单。将之应用于非编码序列是聪明之举，它能够起作用让我感到惊喜。在原理上，这一想法与利用一种功能缺失方法来破坏调控元件而非基因自身是一样的。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9

Systematic identification of noncoding regulatory elements has, to date, mainly relied on large-scale reporter assays that do not reproduce endogenous conditions. We present two distinct CRISPR-Cas9 genetic screens to identify and characterize functional enhancers in their native context. Our strategy is to target Cas9 to transcription factor binding sites in enhancer regions. We identified several functional enhancer elements and characterized the role of two of them in mediating p53 (TP53) and ERα (ESR1) gene regulation. Moreover, we show that a genomic CRISPR-Cas9 tiling screen can precisely map functional domains within enhancer elements. Our approach expands the utility of CRISPR-Cas9 to elucidate the functions of the noncoding genome