One-Step靶向文库制备是怎样炼成的？[新品推荐]

1. 为什么做靶向测序

高通量测序技术的广泛应用，特别是二代测序的普及，使得临床科研人员能够更容易更快速地获取基因组信息。然而，一方面，获取完整基因组仍然费用较高，特别是进行大量临床样本检测时。另一方面，如何发掘隐藏在海量测序数据背后的临床意义仍是短期内无法解决的问题。所以现在就说，我们进入了个人基因组时代还为时尚早。

在临床研究中，大多数的科研人员其实并不需要全部的基因组序列，也难以有效利用如此巨大的数据集。科研人员在很多情况下更需要高精确度的分析，例如检测罕见疾病携带的变异，或是确保临床检测的准确性和重复性。此外，在最新的精准医学中，当人们只关注特定的基因或基因组区域时，受时间、费用和数据存储等因素限制，对特定基因集（几十到几百个热点基因）或是基因组的特定区域进行测序是更为合理的选择。这种测序策略即为靶向测序。靶向测序能更经济地实现大量临床样本的检测，实现远高于基因组测序的测序深度和灵敏度，并且大幅提升突变发现能力。

2. 靶标捕获可以更简单吗

目前主流的靶向序列捕获方案主要有两种，一种基于杂交靶向富集，另一种基于多重PCR靶向富集。现有的靶向文库制备方法都不同程度的存在着均一性差、序列脱靶、操作流程繁复、操作时间长以及高昂的前期设备投入等问题。有没有新的技术可以实现更简单的靶向文库制备，又能获取更高特异性和均一性的文库？是不是能一次反应就能同时完成靶向序列的捕获和测序文库的制备，而不需要额外的实验操作？

答案是肯定的。最近上市的VariantPro™靶向文库制备系统，是一个基于多重PCR又不同于传统多重PCR的靶向文库制备技术，这个系统实现了一步操作即完成从靶向序列捕获到测序文库制备的全过程，而整个过程中只需人工操作5分钟。这个新系统采用了两项专利技术：OmegaPrimer™和RelayPCR™。这两项专利技术又有什么过人之处？

3. 独特的形似Ω的引物

OmegaPrimer™是一个完全不同于传统的，形似Ω的独特引物。这个引物带有3个功能区，5p臂设计保证了引物稳定的结合模板，3p臂设计会双重检查结合特异性并启动聚合酶延伸，两臂之间的loop环起到间隔作用，同时又为后续文库扩增提供通用引物（common primer）杂交的序列（图1）。在OmegaPrimer™中3p臂被设计较短，因而在统计学上，将大幅降低多重PCR体系中形成可扩增引物二聚体几率。这样的设计大幅提升了引物的特异性，同时又能容忍模板出现个别碱基的突变。容忍模板出现个别碱基的突变有什么用处？这是一个非常有用的特性，考虑到在拥有30亿个碱基对的人类基因组中有600万个高等位基因频率（> 1%）的SNPs，平均每500 bp就有1个SNP，这样的引物宽容性就显得非常必要了。

 
图1 OmegaPrimer™含有3个功能区

4. 会自动接力的PCR

RelayPCR™（接力PCR）将一对通用引物和成百上千对（甚至更多）特异性引物（OmegaPrimer™）与基因组DNA混合在一个样品管中。运行一次多重PCR即完成从特异性捕获成百上千个靶向序列（区域）到高均一性制备测序文库的全过程。这个设计带来显著简化的工作流程。具体地，RelayPCR™可以通过控制成百上千对特异性引物（OmegaPrimer™）只在最初靶标捕获的两个循环中发挥作用，之后会自动转换到由一对通用引物（common primer）进行的文库扩增反应。这种实验策略消除了传统多重PCR中多对特异性引物间存在的引物扩增效率差异的现象，从而确保了制备高均一性文库（图2）。在设计通用引物时，可以引入二代测序所需的引物（包括barcode），并且兼容主流的illumina和Ion Torrent测序平台。当全部PCR反应结束后，测序文库也一起制备完毕。

 
图2 RelayPCR™实验流程

由于反应体系中common primer的量远大于specific primer（即omegaprimer™）的量，最初靶标捕获的两个循环结束后，体系中出现了可与common primer杂交的扩增子时，PCR反应即自动切换到由一对common primer引导的文库扩增阶段。与common primer杂交结合的序列，来自omegaprimer™的loop环。

点击观看微电影《一步法制备靶向测序文库》

5. VariantPro™表现如何

 极好的文库均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技术，限制特异性引物（OmegaPrimer™）只在最初2个循环——靶标捕获时发挥作用，接着会自动切换到由通用引物主导的文库扩增循环，直到反应结束，从而确保了生成极高均一性的文库（见图3）。

扩增子覆盖的均一性通常是由＞0.2×扩增子平均覆盖度的序列所占百分比来测定。如下图所示，VariantPro™系统制备的人类线粒体DNA文库达到> 99.1%的均一性。

 
图3 VariantPro™系统制备文库具有极高的文库均一性

 极好的重复性
样品和文库制备步骤中的误差是破坏实验重复性的一个潜在来源。这意味着实验越复杂就越可能增加实验误差的几率。VariantPro™具有极简的工作流程，因而最大限度地降低操作引起的误差。测试实验发现，运行不同的PCR循环数或采用不同的起始DNA量，都不会显著影响测序结果的重复性（见图4，5）。

	15 cycles	17 cycles	19 cycles	21 cycles	23 cycles	27 cycles
15 cycles	1.000	0.992	0.983	0.951	0.978	0.932
17 cycles	0.992	1.000	0.995	0.969	0.984	0.919
19 cycles	0.983	0.995	1.000	0.965	0.980	0.910
21 cycles	0.951	0.969	0.965	1.000	0.973	0.890
23 cycles	0.978	0.984	0.980	0.973	1.000	0.944
27 cycles	0.932	0.919	0.910	0.890	0.944	1.000

图4 不同PCR循环次数（15至27个循环）的相关系数分析表明，PCR循环次数不会影响文库组成。

	1.0 ng	2.5 ng	5.0 ng	7.5 ng	10.0 ng
1.0 ng	1.000	0.991	0.986	0.978	0.952
2.5 ng	0.991	1.000	0.979	0.989	0.973
5.0 ng	0.986	0.979	1.000	0.984	0.956
7.5 ng	0.978	0.989	0.984	1.000	0.984
10.0 ng	0.952	0.973	0.956	0.984	1.000

图5 不同的模板gDNA（1.0至10.0 ng）的相关系数分析表明，反应所需模板量是灵活可变的。

 更低的支出
VariantPro™系统的高性能（高覆盖均一性和靶标特异性）会节约测序成本，只需较低的测序深度就能达到所有碱基足够的覆盖度（见图6）。

	50 x	150 x	300 x	400 x	500 x	700 x	800 x	900 x	1100 x	1500 x
50 x	1.000	0.971	0.966	0.965	0.961	0.973	0.968	0.962	0.962	0.962
150 x	0.971	1.000	0.997	0.996	0.997	0.990	0.997	0.996	0.996	0.994
300 x	0.966	0.997	1.000	0.998	0.995	0.984	0.994	0.994	0.994	0.996
400 x	0.965	0.996	0.998	1.000	0.997	0.984	0.995	0.997	0.995	0.998
500 x	0.961	0.997	0.995	0.997	1.000	0.987	0.998	0.999	0.996	0.995
700 x	0.973	0.990	0.984	0.984	0.987	1.000	0.993	0.985	0.981	0.980
800 x	0.968	0.997	0.994	0.995	0.998	0.993	1.000	0.997	0.994	0.990
900 x	0.962	0.996	0.994	0.997	0.999	0.985	0.997	1.000	0.997	0.994
1100 x	0.962	0.996	0.994	0.995	0.996	0.981	0.994	0.997	1.000	0.991
1500 x	0.962	0.994	0.996	0.998	0.995	0.980	0.990	0.994	0.991	1.000

图6 不同测序深度的相关系数分析（50到1500×）显示扩增子间无显著覆盖差异

 极高的灵敏度与特异性
传统的PCR引物设计往往需要在特异性和引物稳定性之间进行权衡。为应对这个挑战，VariantPro™系统采用的Omega Primer™具有三个功能区：5p臂——负责将引物稳定结合到DNA模板上，3p臂——负责检查序列特异性并启动聚合酶延伸，以及环序列——负责分隔两个臂。使用两个独立的结合区段（5p臂和3p臂）给引物设计提供了更多的自由度，平衡了引物特异性和结合强度。Omega Primer™需要5p臂与3p臂同时结合模板，相比于常规引物，这样的设计显著提高了特异性。

为证明VariantPro™系统的灵敏度和特异性以及检测罕见突变的能力，将一个基因型G11778 G＞A（线粒体基因组）的基因组DNA样品混合进野生型基因组DNA样品中，混合比例从0.5%到10%变化。采用线粒体Panel制备的文库用Illumina NGS平台进行测序分析。分析表明，检测到的突变频率十分接近实际的混合频率，表明突变检测灵敏度> 0.5%（见图7）。

Mutation [ chrMT : 11778 G>A]
Pre-designed frequency	Actual frequency
0.50%	0.58%
1%	2%
2%	2%
5%	8%
10%	14%

图7 检测到的突变频率非常接近实际的混合频率。

 胜任降解DNA样本的检测
为证明VariantPro™系统在降解样本上的检测表现，通过加热250 ng HeLa基因组DNA（体系中加入dsDNA Fragmentase）模拟自然降解。模拟降解反应在37℃分别进行0，10，20，30和50 min。VariantPro™实验使用降解的HeLa基因组DNA为模板进行文库制备，并使用Illumina NGS平台进行分析。相关系数分析表明，模板DNA的不同程度降解对VariantPro™实验结果影响极小。不仅如此，VariantPro™系统也可以胜任所有类型临床样本的靶向文库制备要求。

图8（A）降解DNA的Bioanalyzer分析结果。在37℃孵育20分钟后出现明显的降解（拖尾），随着孵育时间的延长，基因组DNA的平均长度逐渐变短。（B）VariantPro™制备文库的Bioanalyzer分析结果。扩增产物的预期大小约为330 bp。直到基因组DNA片段平均长度下降至200 bp（片段化时间：50 min）都没有显著影响制备文库的大小。

	0 min	10 min	20 min	30 min	50 min
0 min	1.000	0.887	0.871	0.856	0.808
10 min	0.887	1.000	0.984	0.960	0.896
20 min	0.871	0.984	1.000	0.984	0.947
30 min	0.856	0.960	0.984	1.000	0.974
50 min	0.808	0.896	0.947	0.974	1.000

图9 DNA降解对VariantPro™系统的影响。相比于完整的基因组DNA（未片段化），当gDNA模板被消化50 min时，最低的相关系数值高达0.808。

 VariantPro™ Panel具体参数

Capture Method	The VariantPro™ system incorporates novel Relay-PCR™ and Omega Primer™ technologies to form a one-step multiplex PCR based workflow.
Library Type	Commercial or Customer defined library
Amplicon Length	140~280 bp or custom design
Number of Amplicons	Max >20,000 per reaction
Input DNA Required	2~10 ng genomic DNA per library – depending on the DNA quality
Assay Time	4-6 hours
Hands-on Time*	5 minutes
Sequencing Platform	Illumina or Ion Torrent
Coverage Uniformity	> 97% at 0.2 x mean
Enrichment Specifity	97%
Sample Type	Double-Stranded DNA (dsDNA), Tissue (FFPE), Whole Blood, Fine Needle Aspirates (FNA), DNA (Genomic), Clinical Sample, Cell Cultures

*Excluding library clean-up, normalization, and combination

6. 定制检测Panel，So easy！

数量庞大且复杂性极高的PCR引物设计一直是困恼科研人员开展多重PCR的最大障碍，引物特异性差，易出现引物二聚体，引物扩增效率参差不齐，靶向序列脱靶，非靶向序列扩增，扩增子文库均一性差等问题，一直是拦阻科研人员高效使用多重PCR的障碍。

配合VariantPro™系统上线的VariantPro™ Studio引物设计网站（http://www.lc-bio.cn/VariantPro/login.html），依托创新的引物设计算法，远优于传统的基于Tm设计法，可以满足科研人员对任意基因或基因组特定区域的靶向捕获需求。访问VariantPro™ Studio，注册后即可在线提交定制化Panel需求（图10）。只需选择引物设计参数，提交基因名称或指定区域，提交定制化需求后，系统会自动化进行引物设计，并给出基于最优引物所扩增的序列信息。

 
图10 VariantPro™ Studio引物设计界面

7. VariantPro™ Panel都有哪些应用

VariantPro™ Panel具有非常广泛的应用领域。在肿瘤研究领域中，基于VariantPro™技术，将研发出应用于肿瘤基因检测、肿瘤风险基因筛查，以及肿瘤个体化用药指导等panel，如50个肿瘤热点基因检测，乳腺癌、肺癌、结直肠癌风险基因筛查，以及肿瘤个体化用药靶点检测等。在妇婴生育保健领域，基于VariantPro™技术，将研发出新生儿遗传疾病、耳聋基因筛查、线粒体DNA（mtDNA）突变筛查，地中海贫血基因筛查等panel。全长线粒体突变检测panel已在2015年9月上市，100%覆盖人类线粒体基因组（16,569 bp），设计有110对特异性引物，平均扩增子长度为330 bp，最低2 ng基因组DNA，即可对mtDNA的罕见突变进行准确检测。在健康管理领域，基于VariantPro™技术，将研发出包括心血管病易感基因筛查，糖尿病易感基因筛查，精神类疾病筛查，毒素代谢能力筛查，个体体征评估等panel，将有益于提高全民生活与生存质量。在科研领域，使用VariantPro™ Studio将可以设计合成出满足不同研究需求的定制化panel。

VariantPro™系统是迄今为止最简的靶向文库制备系统，只需一次PCR反应，5分钟人工操作，即完成从靶标捕获到文库制备的全过程，获取极高特异性和均一性的文库。

• 极简的操作流程将显著降低操作误差对实验结果的干扰，将更有助于大规模的临床检测应用。
• 简单易用的VariantPro™ Studio将能满足科研和商业的各种定制化的Panel使用需求。
• 只需极低的样品起始量，更低的测序数据量，就能实现高分辨率地靶向检测基因组上的任意区域。

简单到极致的VariantPro™，你值得一试！

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