CRISPR先驱Science再发重量级成果

加州大学伯克利分校的科学家们经过深入研究，揭示了CRISPR-Cas9准备剪切DNA时的关键分子结构，达到了3.4 Å的超高分辨率。这项研究于一月十五日发表在Science杂志上，文章的通讯作者是加州大学伯克利分校的Eva Nogales和Jennifer A. Doudna。

　　

生物通报道：CRISPR-Cas原本是细菌抵御病毒的重要武器，现在它已经成为了基因组编辑的强大工具。风头正劲的CRISPR-Cas不仅操作简便，而且还有着很强的可扩展性，被广泛应用到各种生物中，催生了大量的研究成果。不过，人们还不完全清楚CRISPR-Cas的作用机制，这无疑是该技术进一步发展的一大障碍。

加州大学伯克利分校的科学家们为此展开了深入研究，揭示了CRISPR-Cas9准备剪切DNA时的关键分子结构，达到了3.4 Å的超高分辨率。这项研究于一月十五日发表在Science杂志上，文章的通讯作者是加州大学伯克利分校的Eva Nogales和Jennifer A. Doudna。

在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白与小CRISPR RNA（crRNA）形成复合体，切割与RNA互补的外源DNA。R-loop形成是I型和 II型CRISPR-Cas的一个典型特征，crRNA的引导部分侵入DNA双螺旋，与靶DNA形成RNA–DNA杂交螺旋，同时置换靶DNA的互补链。在CRISPR-Cas9基因组编辑中广泛使用的sgRNA就会和Cas9形成这种R-loop。

为了阐明R-loop的作用，研究人员通过冷冻电镜（cryo-EM）获得了酿脓链球菌Cas9 R-loop的高分辨率结构。不久之前，冷冻电镜还不是大多数结构生物学家们的第一选择。随着硬件设备、软件算法等方面的突破，现在冷冻电镜已经成为了X射线晶体衍射的有力竞争者，不仅在分辨率上能够与之匹敌，还适用于难以结晶的大分子。这一技术为结构生物学和药物研发领域带来了一场革命。

R-loop互作发生在与引导RNA互补并且具有短PAM模体的靶DNA序列上，Cas9通过HNH和RuvC核酸酶结构域在PAM上游剪切双链DNA。研究显示，被RNA取代的DNA链位于RuvC结构域的活性位点附近。蛋白与DNA的互作进一步将HNH结构域安置在靶DNA链的切割位点附近。Cas9使DNA螺旋弯曲30°，为R-loop形成提供必要的结构扭曲。

这项研究的领导者Jennifer A. Doudna是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（Breakthrough Prize），是CRISPR专利的有力竞争者。近年来，Doudna一直致力于探索CRISPR-Cas系统的具体作用机制，取得了极为丰硕的成果。

2015年4月2日Doudna领导的研究团队在Science杂志上发表文章，为人们揭示了CRISPR-Cmr 复合体结合靶标的具体机制。他们通过冷冻电镜技术获得了天然III型Cmr复合体及其与目标RNA结合时的分子结构，获得了接近原子水平的高分辨率。（更多详细信息请参见：CRISPR先驱Science、Nature相继发表最新成果）

2015年10月28日，Doudna及其同事在Nature杂志上发表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。他们通过分子内荧光共振能量转移（FRET）实验，鉴定了HNH核酸酶结构域的一种激活构象。研究还证实，一个α-螺旋将HNH的构象改变传达给RuvC结构域，激活它实现DNA切割。（更多详细信息请参见：Nature：揭示CRISPR/Cas9的DNA靶向切割机制）

2015年11月12日，Doudna等人在Science杂志上为人们展示了Cas9识别基因组靶标的重要机制。研究显示，Cas9的搜索和快速“跳过”机制是确保CRISPR作用的前提。这一发现将有助于进一步完善CRISPR基因编辑技术。（更多详细信息请参见：Nature，Science揭示CRISPR“跳过”机制）

 

生物通编辑：叶予

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