Nature子刊发布CRISPR-Cas9突破性技术成果

【字体: 时间:2016年01月20日 来源:生物通

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  来自Broad研究所遗传干扰平台(GPP)和微软研究所的研究人员报告称,他们开发出了一种预测模型可以揭示出哪些单导向RNA (sgRNA)序列能够与基因组工程工具CRISPR-Cas9彼此最佳组对来成功地探查基因组。这一研究小组将他们的方法报告在了本周的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。

  

生物通报道  来自Broad研究所遗传干扰平台(GPP)和微软研究所的研究人员报告称,他们开发出了一种预测模型可以揭示出哪些单导向RNA (sgRNA)序列能够与基因组工程工具CRISPR-Cas9彼此最佳组对来成功地探查基因组。这一研究小组将他们的方法报告在了本周的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上,并将通过Addgene公司向科学团体提供他们建立的针对人类和小鼠基因组的优选sgRNAs清单。

在过去的几年里,细菌免疫系统CRISPR-Cas9已成为了在实验室中最有效的一种扰乱基因的手段—它能够在整个基因组中系统地改变或“敲除”基因功能,来确定感兴趣的基因在一个生物系统中的功能。为了让CRISPR系统能够在这样的筛查中敲除一些基因,它的天然酶——被比喻为“分子剪刀”的DNA切割酶Cas9必须要搭配sgRNA。sgRNA是一段长度大约为20个核苷酸的RNA序列,其能够导向追踪靶DNA遗传密码中的匹配序列。当sgRNA找到它的目标时,Cas9会在靶位点切割DNA,敲除基因。关闭基因所产生的生物学影响可以揭示出这一基因在生物体内所起作用的一些重要线索。

尽管CRISPR-Cas9系统使得这类筛查变得前所未有的简单,但它还并不完美。有成百上千的潜在sgRNAs可用于靶向指定的基因,并非所有的sgRNAs都同样能够很好地对靶位点起作用。还存在一种所谓的“脱靶”风险:即Cas9/sgRNA结构结合到一个意想不到的靶点,造成不必要的基因活性破坏,混淆筛查结果。这样的脱靶效应也成为考虑在活细胞中测试CRISPR-Cas9的研究人员所关注的一个问题。

近年来,一些研究团队一直在想法设法来攻克CRISPR-Cas9技术这一非常重要的限制。在发表于Nature杂志上的一篇新研究论文中,麻省总医院(MGH)的研究人员描述了改造Cas9酶,减少它与靶DNA的非特异性互作,大大扩展这一基因编辑技术应用的过程(延伸阅读:Nature发布突破性CRISPR-Cas9新技术 )。

麻省理工学院-哈佛医学院Broad研究所和麻省理工学院McGovern脑研究所的张锋(Feng Zhang)和同事们则在Science杂志上报告称,他们通过改变构成化脓性链球菌Cas9酶的3个氨基酸,将“脱靶编辑”显著减少到了无法检测到的水平(延伸阅读:张锋Science重大突破:攻克CRISPR-Cas9基因组编辑的主要障碍 )。

还有,哈佛大学David Liu研究组和麻省总医院Keith Joung研究组提出,对Cas9进行基因工程改造,让其依赖二聚化才能酶切,就像锌指核酸酶(ZFN)和TALEN那样。二聚化酶有着更严格的序列要求,理论上应该能够大大减少脱靶位点的数量(延伸阅读:三篇Nature子刊:如何克服CRISPR的脱靶效应 )。

在最新Nature Biotechnology的文章中,研究人员表示他们意识到,想要优化CRISPR-Cas9系统的脱靶活性,将脱靶效应减至最少,鉴别出在许多可用的sgRNAs谁最能够最稳定地找到它们的靶标将会有用。

由于不可能测试针对人类基因组中2万个基因的成百上千个sgRNAs,他们转而测试了针对在一些CRISPR筛查中已充分研究功能和性能的一小组(大约20个)基因的sgRNAs。他们的想法是寻找预计在靶向性能方面显示更大成功的RNA导向序列。最终,GPP研究小组和微软研究所合作利用一种“机器学习”方法,构建出了精选sgRNAs文库。

论文的共同资深作者、Broad研究所遗传干扰平台高级主任总结了这些文库对于科学研究的价值:“最大的好处是:研究人员在进行CRISPR-Cas9实验室将获得更好的平均成功率。由于有着更可靠的靶向数据,它们将有效筛查基因组更多区域;它们将生成较少因脱靶效应导致的错误或误导性研究发现;它们将更多地了解生物学。”

当前这些文库只推荐匹配化脓性链球菌Cas9(现在在CRISPR筛查中最常用的酶)的sgRNA,但研究小组期望他们的机器学习模型可帮助构建出针对其他CRISPR基因工程系统,包括去年发现的Cas9替代物的优化sgRNA文库。

(生物通:何嫱)

生物通推荐原文索引:

Doench, J et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects for genetic screens with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. Online January 18, 2016. DOI:10.1038/nbt.3437 


 

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