Nature Biotechnology:实现前所未有的CRISPR基因编辑成功率

【字体: 时间:2016年01月22日 来源:生物通

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  加州大学伯克利分校的研究人员对CRISPR-Cas9技术做出重大改进,在用一段短DNA片段替代另一段DNA时获得了高达60%的前所未有的成功率。研究人员在1月21日的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上描述了他们的这项新技术。

  

生物通报道  加州大学伯克利分校的研究人员对CRISPR-Cas9技术做出重大改进,在用一段短DNA片段替代另一段DNA时获得了高达60%的前所未有的成功率。研究人员在1月21日的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上描述了他们的这项新技术。

这一改进的技术在试图去修复导致遗传性疾病,如镰状细胞病或严重联合免疫缺陷的遗传突变之时尤其有用。它使得研究人员能够用正常的序列来修补异常的DNA片段,并有潜力修复这一缺陷,其已在细胞培养物中发挥作用促进了修复缺陷基因。

加州大学伯克利分校创新基因组学计划科学主任Jacob Corn说:“CRISPR-Cas9令人兴奋的地方在于它有希望在我们基因组中适当的地方修复基因,但效率可能很低。如果你将基因编辑视作是一台文字处理机,我们知道如何了剪切,但我们需要一种更有效的方法在我们进行剪切的位点粘贴胶合一段新的DNA片段。”

短DNA片段出现问题,包括单碱基突变,是许多遗传疾病的典型特点。“在你想改变一些长度为30bp的极小DNA区域的情况下,这一技术将会是非常有效的,”论文的第一作者、创新基因组学计划博士后Christopher Richardson说。

Richardson发现Cas9在完成了对双链DNA切割的很长时间后——长达6小时内仍然附着在染色体上,据此开发出了这一新方法。Richardson仔细观察了结合两条DNA链的Cas9蛋白,发现这一蛋白紧紧抓住了三个切口端,而有一个切口端不受牵制。

当Cas9切割DNA时,细胞中的修复系统会抓住一段互补DNA片段,作为模板来修复切口。研究人员可以添加一些模板——这些模板对基因组中的现有序列做了一些改变,例如纠正了致病突变。

Richardson推测,将这一替代模板直接带到切割位点,将会提高修复效率。他构建出了一个DNA片段,其与自由的DNA端相匹配,并携带着将插入到另一端中去的遗传序列。这一技术能够极好地发挥作用,使得突变的修复成功率达到了60%。

Richardson说:“我们的数据表明,在分子水平上Cas9造成的断裂与其他靶向核酸酶如TALENS和锌指核酸酶生成的断裂可能是不同的,这意味着我们正在采用的策略可以让你更有效地修复Cas9造成的断裂。”

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研究人员还证实,一些结合但不切割DNA的Cas9蛋白变异体也可以在结合位点成功地粘贴一段新DNA序列,其有可能通过在靶DNA上形成一种“泡状”结构来发挥作用吸引了修复模板。Corn说,利用不切割基因组的Cas9来进行基因编辑,消除了在基因组中发生脱靶切割的危险,有可能比标准的基因编辑更安全。

在一些研究小组正致力扩展CRISPR-Cas9技术基础与临床应用的同时,另一些研究人员也在不断努力设法提高这一技术的效率,扩大它的靶向范围及解决脱靶效应这一问题。

来自中科院动物研究所的王皓毅研究员在2015年6月《Genetics》杂志上的一篇研究论文中证实,利用电流来传送CRISPR/Cas9系统,不仅使得CRISPR/Cas9能够高效地实现实验室小鼠遗传改造,并且可显著提高这一系统的通量(延伸阅读:王皓毅博士:提高CRISPR/Cas9效率和通量的新策略 )。

Whitehead研究所的科学家通过添加一种抗癌药物Scr7到遗传编辑的受精卵中,将CRISPR/Cas的效率显著提高了19倍。这一重要的成果发表《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上(延伸阅读:Nature技术突破:将CRISPR效率提高19倍 )。

来自麻省总医院(MGH)的一个研究小组通过采用KKH SaCas9的变体,将CRISPR-Cas9的靶向范围提高了2-4倍。这一成果发布在2015年11月的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上(延伸阅读:Nature Biotechnology:扩大CRISPR-Cas9的靶向范围 )。

(生物通:何嫱)

生物通推荐原文摘要:

Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA

Targeted genomic manipulation by Cas9 can efficiently generate knockout cells and organisms via error-prone nonhomologous end joining (NHEJ), but the efficiency of precise sequence replacement by homology-directed repair (HDR) is substantially lower1, 2. Here we investigate the interaction of Cas9 with target DNA and use our findings to improve HDR efficiency. We show that dissociation of Cas9 from double-stranded DNA (dsDNA) substrates is slow (lifetime ~6 h) but that, before complete dissociation, Cas9 asymmetrically releases the 3′ end of the cleaved DNA strand that is not complementary to the sgRNA (nontarget strand). By rationally designing single-stranded DNA (ssDNA) donors of the optimal length complementary to the strand that is released first, we increase the rate of HDR in human cells when using Cas9 or nickase variants to up to 60%. We also demonstrate HDR rates of up to 0.7% using a catalytically inactive Cas9 mutant (dCas9), which binds DNA without cleaving it.

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