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关于数字PCR,这些干货请收好[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年11月14日 来源:生物通

摘要:

  20多年来,数字PCR技术经过不断改进,已应用在多个方面,包括定量癌症标志物、测定病毒载量、区分基因组变异、验证新一代测序的结果、基因表达分析、转基因检测以及环境监测等。尽管这种技术并不复杂,但经验也是十分重要的。为此,Bio-Rad的专家贡献出一些宝贵的tips,帮助你开始并优化dPCR实验。

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相对于传统的qPCR而言,数字PCR(dPCR)是一种高度灵敏的存在,能够实现核酸的绝对定量和稀有等位基因的检测。这种方法是在PCR扩增之前对样品进行微滴化处理,将DNA或cDNA样品分成上万个微滴,其中每个微滴或不含DNA靶分子,或含有一个或数个靶分子。每个微滴作为一个单独的PCR反应,利用终点法PCR对DNA进行扩增。在扩增后,分析每个微滴中荧光信号的存在(阳性)或不存在(阴性)。根据泊松分布原理及阳性微滴的比例可确定样品中靶分子的绝对数量。

20多年来,数字PCR技术经过不断改进,已应用在多个方面,包括定量癌症标志物、测定病毒载量、区分基因组变异、验证新一代测序的结果、基因表达分析、转基因检测以及环境监测等。尽管这种技术并不复杂,但经验也是十分重要的。为此,Bio-Rad的专家贡献出一些宝贵的tips,帮助你开始并优化dPCR实验。

样品制备

使用多少起始DNA

DNA起始量将取决于你所用的数字PCR系统。对于Bio-Rad的微滴式数字PCR系统(ddPCR),每孔大约需要1-100,000个拷贝的DNA靶分子。这相当于3.3 pg至350 ng的人基因组DNA。最好是每孔30,000个拷贝。对于其他生物,每个拷贝的基因组大小需要计算。对于很小的基因组,如细菌和病毒,可能需要稀释几次,才能达到这个范围。对于基因表达实验,起始cDNA的量将取决于目标的表达水平。

扩增前浓缩FFPE样品

在处理高度降解的DNA,如FFPE样品时,可定量的DNA与可扩增的完整DNA之间可能存在比较大的差异。根据经验,只有40%的FFPE DNA是可以扩增的。因此,加入更多的DNA是一个明智选择。不过,FFPE样品通常含有抑制剂,有时加少一点也有好处。因此,为了让实验更成功,建议预先浓缩DNA样品。

实验设计

降低升降温速率

如今,热循环仪的升降温速率让人咋舌。不过,PCR反应中的液滴是静止不动的,降低了正常热扩散的速率。因此,热循环仪的升降温速率应降低至每秒2°C,以确保更均匀的热传递。对于某些检测,所有液滴的均匀热循环可以带来更干净的数据。

修改PCR扩增条件

在处理棘手的模板时,可以更改PCR循环条件。

• 对于较长的扩增子(> 400 bp),更改两步法或三步法操作,加入一个1-6分钟的72°C延伸循环,这取决于扩增子的长度。
• 大多数细菌和病毒可直接制成微滴,而不需要样品制备和DNA分离。将PCR操作的95°C 10分钟更改为98°C 10分钟,以便裂解细菌或病毒。
• 对于富含GC的模板,尝试将PCR循环条件从94°C 10秒更改为96°C 10秒,以协助扩增。

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