关于数字PCR，这些干货请收好[心得点评]

相对于传统的qPCR而言，数字PCR（dPCR）是一种高度灵敏的存在，能够实现核酸的绝对定量和稀有等位基因的检测。这种方法是在PCR扩增之前对样品进行微滴化处理，将DNA或cDNA样品分成上万个微滴，其中每个微滴或不含DNA靶分子，或含有一个或数个靶分子。每个微滴作为一个单独的PCR反应，利用终点法PCR对DNA进行扩增。在扩增后，分析每个微滴中荧光信号的存在（阳性）或不存在（阴性）。根据泊松分布原理及阳性微滴的比例可确定样品中靶分子的绝对数量。

20多年来，数字PCR技术经过不断改进，已应用在多个方面，包括定量癌症标志物、测定病毒载量、区分基因组变异、验证新一代测序的结果、基因表达分析、转基因检测以及环境监测等。尽管这种技术并不复杂，但经验也是十分重要的。为此，Bio-Rad的专家贡献出一些宝贵的tips，帮助你开始并优化dPCR实验。

样品制备

使用多少起始DNA

DNA起始量将取决于你所用的数字PCR系统。对于Bio-Rad的微滴式数字PCR系统（ddPCR），每孔大约需要1-100,000个拷贝的DNA靶分子。这相当于3.3 pg至350 ng的人基因组DNA。最好是每孔30,000个拷贝。对于其他生物，每个拷贝的基因组大小需要计算。对于很小的基因组，如细菌和病毒，可能需要稀释几次，才能达到这个范围。对于基因表达实验，起始cDNA的量将取决于目标的表达水平。

扩增前浓缩FFPE样品

在处理高度降解的DNA，如FFPE样品时，可定量的DNA与可扩增的完整DNA之间可能存在比较大的差异。根据经验，只有40%的FFPE DNA是可以扩增的。因此，加入更多的DNA是一个明智选择。不过，FFPE样品通常含有抑制剂，有时加少一点也有好处。因此，为了让实验更成功，建议预先浓缩DNA样品。

实验设计

降低升降温速率

如今，热循环仪的升降温速率让人咋舌。不过，PCR反应中的液滴是静止不动的，降低了正常热扩散的速率。因此，热循环仪的升降温速率应降低至每秒2°C，以确保更均匀的热传递。对于某些检测，所有液滴的均匀热循环可以带来更干净的数据。

修改PCR扩增条件

在处理棘手的模板时，可以更改PCR循环条件。

• 对于较长的扩增子（> 400 bp），更改两步法或三步法操作，加入一个1-6分钟的72°C延伸循环，这取决于扩增子的长度。
• 大多数细菌和病毒可直接制成微滴，而不需要样品制备和DNA分离。将PCR操作的95°C 10分钟更改为98°C 10分钟，以便裂解细菌或病毒。
• 对于富含GC的模板，尝试将PCR循环条件从94°C 10秒更改为96°C 10秒，以协助扩增。

数据分析

寻找真正的阳性样品

为了确定一个样品是否为真阳性，Bio-Rad有个好建议。根据无模板对照（NTC）来确定假阳性率（FPR）。接着，将每孔的阳性微滴数量乘以3。阳性样品中阳性微滴的数量至少是FPR的三倍。

在检测稀有的DNA时，可能需要7-10 μg的DNA。如何确定的呢？若要在1000个背景分子中找到一个稀有目标，或0.1%的灵敏度，根据3的规则，你要在3000个背景分子中找到至少3个阳性微滴，才具有统计意义。3000个拷贝的单倍体基因组相当于1500个细胞或10 ng DNA。因此，若要达到0.0001%的灵敏度，需要筛查10 μg DNA。

了解误差线

在ddPCR系统中，每孔的误差线代表了95%的置信区间。如果合并多个孔，如技术重复，将出现两条误差线。外侧的误差线代表了这些重复的平均数标准误差，而内侧的误差线代表了泊松分布的95%置信区间，现在是基于三个孔的微滴总数。

更多建议

消化样品

当gDNA的用量超过66 ng时，建议使用限制性内切酶来消化。在处理质粒时，消化可将质粒线性化，获得超螺旋DNA，实现质粒的准确定量。此外，消化对于拷贝数分析也是很重要的，可确保串联重复的分离。在处理FFPE样品时，也建议消化，以确保所有降解的FFPE样品都能消化至相同程度。

消化可在ddPCR混合液中直接进行。使用高保真的限制性内切酶，并确保它们不会切割扩增子。如果面对的是特别困难的模板，如富含GC的模板，试试切割四个碱基或六个碱基的内切酶。

使用多个参考基因

在评估拷贝数变异（CNV）时，特别是癌症样品时，必须确保参考检测稳定在每个基因组2个拷贝。在癌症样品中，参考检测本身往往扩增或缺失。因此，Bio-Rad建议尝试多个参考基因，并提供4种标准检测和57种近着丝粒检测，以确保CNV检出是正确的。

结语

如今，科学界要求更高的数据准确性和更可靠的结果，因此，数字PCR等可检测和定量低浓度核酸的技术就变得越来越流行。在使用数字PCR时，若你在设置实验、运行检测和分析结果时不幸遇到问题，以上的建议也许能助你一臂之力。（生物通 余亮）

深入了解Bio-Rad的微滴式数字PCR系统