关于ccfDNA的提取，你想知道的都在这里 [心得点评]

自2015年以来，液体活检就在医疗诊断领域掀起了一阵新风暴。这是一种非侵入性的方法，有望替代目前的侵入性方法，在早期实现疾病的诊断和监控。如今，液体活检已经应用在无创产前诊断（NIPT）、癌症的诊断和治疗等多个方面。在这些检测中，两大主角分别是循环游离DNA（ccfDNA）和循环肿瘤细胞（CTC）。

对于循环游离DNA的研究，QIAGEN近日推出了专用的采血管 – PAXgene Blood ccfDNA Tube，用于血液样本的采集和稳定。它的材质是特殊处理的高硬度透明塑料，可对抗运输过程中的撞击。采血管采用了一种非交联反应的稳定剂，可有效防止溶血及gDNA的释放，最大限度减少ccfDNA的改变。

关于ccfDNA的采集以及采血管的使用，QIAGEN的专家整理了人们最感兴趣的9个问题，在这里将答案与大家分享。

Q：采血量的最低要求是多少？
A： 对于市场上的大多数试剂盒，每次需要抽取8-10 ml血液，才能进一步处理血浆和ccfDNA。PAXgene Blood ccfDNA Tube也类似，每次需要抽血10 ml。这种做法是为了确保真空管被装满时，每毫升血液中细胞稳定添加剂的量是0.15 ml。

Q：你所谈到的血液采集指的是全血、血清还是血浆？
A：对于样本采集，PAXgene Blood ccfDNA Tube采集的是人类全血。随后你可以通过产品附带的操作说明来处理血浆。ccfDNA可以利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit手动纯化，也能利用PAXgene Blood ccfDNA Kit自动纯化。

Q：利用这种技术来获取母亲的血液样本，是否可以确定胎儿的性别？
A：我们已经做了这样的测试，不过需要注意的是，PAXgene Blood ccfDNA system是仅供科研使用的。一名用户使用了PAXgene Blood ccfDNA Tube以及QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit和QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit。他们采集了母亲血液，并分析了43个样品中的胎儿组分。之后利用Lifecodexx的PrenaTest成功确定胎儿的性别。分析结果表明，PAXgene Blood ccfDNA方法的结果与现有方法一致。

Q：DNA提取和PCR分析应采用什么样的血液稳定操作？
A：如果你能防止交联剂对DNA的修饰，那是再好不过了。PAXgene Blood ccfDNA Tube采用一种替代的解决方案，不涉及到交联。这种方案可以减少gDNA的释放，并有效防止溶血，在保留样品完整性的同时，防止对DNA的修饰。

Q：ccfDNA的分离操作是手动的还是自动的？
A：两者皆可！选择哪个试剂盒，取决于你希望在工作台上手动分离，还是交给仪器去完成，因为每种方法采用不同的试剂来提取ccfDNA。QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit是一种手动方法，它利用硅胶膜离心柱从血浆样本中提取ccfDNA。这个手动过程包括4个步骤：裂解、结合、洗涤和洗脱，可灵活选择1-5 ml的血浆上样量。对于自动化分离，可以选择QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit。这个试剂盒可选择加入2.4 ml或4.8 ml的血浆。自动化操作采用磁珠技术让ccfDNA结合在磁珠的表面，确保快速分离得到高纯度的ccfDNA样品。

Q：如何定量分离出的ccfDNA？
A：鉴于ccfDNA的性质，这种游离DNA可能难以定量。对于健康个体，它的产量大约在每4 ml血浆中1-100 ng这个范围。若是研究对象处于各种疾病状态，则ccfDNA的浓度甚至远远超出这个范围。对定量而言，我们建议使用定量PCR或数字PCR。

Q：蝴蝶针采血适用于PAXgene Blood ccfDNA tube吗？
A：是的，PAXgene Blood ccfDNA tube适用于标准的血液采集设备。你也可以参考PAXgene Blood ccfDNA tube的操作手册，了解样本采集的更多内容。

Q：血液中的DNA甲基化状态是否保留？
A：是的，通过PAXgene Blood ccfDNA System纯化得到的ccfDNA可以与甲基化检测兼容，比如那些需要用亚硫酸氢盐处理的检测。之前，QIAGEN的科学家利用Agilent Bioanalyzer，在2个时间点（0天和6天）比较了EDTA、Streck和PAXgene Blood ccfDNA Tube的性能。他们发现，Streck样品的主要ccfDNA峰在6天后位移了7-8 bp，这表明试剂对DNA的修饰。

Q：哪些下游应用可分析ccfDNA？
A：目前有多种技术可分析ccfDNA，包括新一代测序、PCR、qPCR、数字PCR和SNP基因分型。到目前为止，利用PAXgene Blood ccfDNA System处理后获得的ccfDNA已经成功用于NGS和PCR，包括多重qPCR和ddPCR。

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