北大魏文胜课题组：提高基因敲除效率的新方法

　　

生物通报道：基因组编辑技术，可让科学家们能够在各种哺乳动物细胞系中实现基因敲除。然而，用一种典型的方法，以一种及时的方式，完全破坏一个靶基因，在技术上是具有挑战性的。为了提高产生可靠基因组修饰的效率，北京大学生命科学学院魏文胜课题组，设计了一种方法，其使用一个线性供体片段，该片段包含一个报告系统。结合一种不依赖于同源重组（HR）的敲入策略，研究人员成功地富集了特异性携带靶基因突变的细胞克隆。相关研究结果发表在11月1日的《FEBS Letter》杂志。延伸阅读：北大魏文胜最新发表CRISPR综述；北大魏文胜权威期刊连发重要成果；魏文胜、刘小乐携手发表CRISPR新成果。

基因组编辑技术彻底改变了基因功能的实验性研究。三大主要技术：ZFN（锌指核酸酶）、TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶）和CRISPR / CAS系统，采用不同的机制来产生序列特异性双链断裂（DSB），随后触发本地修复系统来完成序列特异性的修饰。这些强大的技术在功能基因研究、染色体位点的动态和实时成像、疾病突变的纠正、基因疗法中有着广泛的应用。

CRISPR / Cas系统由于其效率高、易操作，而变得尤为流行。然而，虽然CRISPR / Cas系统在基于设计和序列特异性的基因组研究中具有前所未有的力量，但它在哺乳动物细胞中产生基因敲除的简单任务，在技术上仍然是有挑战性的。

科学家们已经作出了各种努力，来提高产生基因敲除的效率。然而，各种缺点限制了这些技术的一般和广泛应用，甚至敲除一个单一基因有时是一个漫长、繁琐和高风险的过程。特别是，在哺乳动物细胞中产生多基因敲除，仍然是一项艰巨的任务。

如果靶基因中断产生的表型变化，可用于富集，就很容易得到基因敲除的克隆，如HeLa CSPG4−/−细胞赋予艰难梭菌毒素B抗性。然而，这种策略不能普遍应用。获得基因敲除的传统方法是把表达Cas9和sgRNA的质粒，与表达耐药性或荧光蛋白的质粒共转染，但这个选择不会增加突变率或富集包含靶修饰的那一小部分细胞。

先前已有研究报称，如果一个同源等位基因被修改，靶等位基因的突变频率一般是很高的。该研究小组认为，如果我们可以在其中一个靶等位基因上的特定位点插入一段供体序列，并选择表达供体遗传标记基因的克隆，我们就能够富集这些罕见的事件，其中所有的等位基因是被修改的。已有研究表明，外源dsDNA片段可通过不同的修复机制，被整合到具有双链断裂（DSBs）的染色体位点中。比起通过同源重组修复（HR），通过NHEJ介导的DNA修复，一般具有更高的整合效率。为了确保供体序列的插入效率，并避免克隆长侧翼序列克隆的麻烦，该研究小组使用CRISPR/Cas9引发的HR独立性DNA修复，来介导外源线性供体DNAs的插入。

结合不依赖于同源重组（HR）的敲入策略，该研究小组成功地富集到那些特异性携带靶基因突变的细胞克隆。当把这种特殊程序与CRISPR/Cas9系统相结合使用，员在一步式程序中产生单个和多个基因敲除时，研究人员观察到了大大提高的成功率。这种新的方法进一步增强了基因及其功能的分子生物学研究。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Simultaneous generation of multi-gene knockouts in human cells
Abstract: Genome-editing techniques enable the generation of gene knockouts in various mammalian cell lines. However, it remains technically challenging to completely disrupt a targeted gene using a canonical method in a timely manner. To improve the efficiency of producing reliable genomic modifications, we designed a method using a linear donor fragment containing a reporter system. Combined with a homologous recombination (HR)-independent knock-in strategy, we successfully enriched those cell clones that specifically carry the target-gene mutations. We observed a much improved success rate when generating single- and multiple-gene knockouts in a one-step procedure using this special protocol coupled with the CRISPR/Cas9 system. This new approach further empowers the molecular biological study of genes and their functions.