同期中国学者连发两篇文章 聚焦CRISPR-C2c1系统

　　

生物通报道：去年Broad研究所的张锋研究组采用了一种新生物信息学方法发现了暂时被命名为C2c1、C2c2和C2c3的新蛋白，这些蛋白的发现有望进一步扩大基因组编辑工具箱，为生物医学研究开辟新的途径。

近期来自中科院生物物理研究所的研究人员解析了结合有sgRNA的C2c1晶体结构，并发现C2c1对应的sgRNA呈现出一种与Cas9对应的sgRNA或最近报道过的Cpf1所对应的crRNA显著不同的结构。这有助于开发新的基因组编辑工具，降低基因编辑过程中的脱靶现象。

相关研究成果在线公布在12月15日的Molecular Cell杂志上，文章的通讯作者是中科院生物物理研究所王艳丽研究员，王艳丽研究组主要研究方向为CRISPR/Cas系统的作用机理研究与小分子介导的基因沉默的结构生物学研究，其研究组去年解析了Cas1-Cas2与多种类型DNA的复合物的晶体结构，发现了Cas1-Cas2识别外源入侵DNA分子机制。

在最新研究中，研究人员解析了结合有sgRNA的C2c1晶体结构。该结构显示C2c1由两个区域构成，分别是具有识别sgRNA功能的REC区域和具有核酸酶功能的NUC区域。sgRNA是由crRNA和tracrRNA人工嵌合而成，其中，crRNA结合在C2c1的中心孔道内，tracrRNA则被安置在C2c1外表面的凹槽中。

有趣的是，通过进一步观察，研究人员发现C2c1对应的sgRNA呈现出一种与Cas9对应的sgRNA或最近报道过的Cpf1所对应的crRNA显著不同的结构。受到这个新结构的提示，研究人员一方面分析了其他物种的C2c1所对应的sgRNA结构，另一方面缩短了该sgRNA的长度，并进行活性实验，这两方面的结果都初步验证了这种独特结构的真实性和有效性。

此外，该研究还发现目的序列的单个碱基突变可以显著降低C2c1剪切活性，这表明C2c1对靶定的目的序列有极其严格的要求，这一研究结果有助于开发新的基因组编辑工具，降低基因编辑过程中的脱靶现象。

同时生物物理所的高璞研究组也与Sloan研究所的Dinshaw J. Patel教授合作，在Cell上发文，解析了C2c1-sgRNA二元复合物及C2c1-sgRNA-DNA多种三元复合物结构。并且他们通过结构分析，揭示了C2c1不同于Cas9和Cpf1的独特target DNA识别和切割方式。

而且研究人员还首次明确了C2c1对双链DNA的切割会产生7nt的粘性末端。这是目前所有用于基因组编辑的CRISPR-Cas系统所能产生的最长粘性末端，将有希望提高切割后的连接效率。青年**学者发表Cell新文章：两种新型CRISPR-Cas系统

（生物通：万纹）

作者简介：

王艳丽，中科院“****”　获得者

　　中科院生物物理所，中国科学院核酸生物学重点实验室，创新课题组组长

　　研究方向：

　　（1）CRISPR/Cas系统的作用机理研究

　　（2）小分子介导的基因沉默的结构生物学研究

研究工作主要集中在以下两个方面：

　　（1）CRISPR/Cas系统的作用机理研究

　　CRISPR/Cas系统是源于细菌和古细菌的一种后天免疫系统，它是近年来发现的由小分子RNA介导的免疫系统。Ⅰ型CRISPR系统的crRNA加工成熟后，与多个Cas蛋白结合形成cascade 复合物，通过crRNA序列特异性地识别，并招募 Cas3蛋白对外源入侵核酸序列剪切。2014年本课题组成功解析了分辨率为3埃的E.coli Cascade复合物结构，揭示了由11个Cas蛋白以及一个61核苷酸的crRNA共同组成的分子量为405kDa的Cascade复合物的精确的组装方式，揭示了CRISPR作用的分子机理，同时也为进一步了解靶标的识别机制提供了新的信息。2015年解析了Cas1-Cas2与多种类型DNA的复合物的晶体结构，发现了Cas1-Cas2识别外源入侵DNA分子机制，揭示了外源核酸片段的长度是如何确定的，同时也解释了该阶段中的核心蛋白Cas1和Cas2各自的功能。因此，该成果为揭示原核生物这一新的抵御病毒及遗传物质的入侵的机制奠定了重要的理论基础。

　　（2）小分子介导的基因沉默的结构生物学研究

　　在小分子RNA介导的基因沉默的过程中，探索Ago蛋白与向导链的构象变化，深入分析miRNA诱导基因沉默的机理。RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA介导的特异性基因沉默现象。Argonaute蛋白是RNA基因沉默途径中核心元件，其PIWI结构域能够催化引导链介导的mRNA的特异性降解。通过解析argonaute蛋白与引导链及靶RNA等复合物的结构，详细解释了argonaute沉默复合体参与调控基因沉默的具体途径和方式，阐明了其如何选择并切割RNA分子，最终降解RNA分子使基因沉默的过程。　

原文摘要：

C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism

C2c1 is a type V-B CRISPR-Cas system dual-RNA-guided DNA endonuclease. Here, we report the crystal structure of Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 in complex with a chimeric single-molecule guide RNA (sgRNA). AacC2c1 exhibits a bi-lobed architecture consisting of a REC and NUC lobe. The sgRNA scaffold forms a tetra-helical structure, distinct from previous predictions. The crRNA is located in the central channel of C2c1, and the tracrRNA resides in an external surface groove. Although AacC2c1 lacks a PAM-interacting domain, our analysis revealed that the PAM duplex has a similar binding position found in Cpf1. Importantly, C2c1-sgRNA system is highly sensitive to single-nucleotide mismatches between guide RNA and target DNA. The resulting reduction in off-target cleavage renders C2c1 a valuable addition to the current arsenal of genome-editing tools. Together, our findings indicate that sgRNA assembly is achieved through a mechanism distinct from that reported previously for Cas9 or Cpf1 endonucleases.