经典回顾：15分钟实现无缝克隆的In-Fusion技术

克隆是一件很酷的事情。利用限制性内切酶来处理载体和片段，可以使它们成为两块契合的拼图，然后“啪”地一声拼在一起，就成为理想中的重组载体。这种经典操作已经流行了几十年，为人们所熟知。不过，如果你需要克隆多个片段，或者引入突变，你会觉得这一点也不酷。传统克隆有着一定的限制，操作也相当的繁琐。

然而，在Clontech（现在的Takara Bio USA）推出In-Fusion克隆技术后，你才发现，原来克隆还可以更酷。这个设计巧妙的产品操作简单方便，不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作，在15分钟内，能将任何PCR产物片段定向克隆到任何载体上。真正一步解决PCR克隆上的所有技术烦恼。

In-Fusion的原理

In-Fusion克隆技术的基础是Clontech的In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端的15 bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。你只需将目的片段和线性化载体与预混合酶试剂相混合，在50℃孵育15分钟就行了。

对研究人员来说，最幸福的地方就在于可以使用任何自备的载体。你只需选择适当的表达载体，选择最佳的酶切位点，单酶切或双酶切后得到线性化载体即可。即使没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。这样，你就不需要重复的亚克隆，也不需要T载体那样的中间载体。

此外，你也不用担心克隆留下的“小疤痕”了。In-Fusion克隆不附加任何多余序列，可实现完美的无缝克隆，对构建表达载体来说是再理想不过了。由于PCR产物两端的序列不同，这种类似同源重组的反应是精确定向的，不需要检验插入片段的方向，也为你节省了不少时间和精力。

In-Fusion的应用

多片段克隆
对于传统的克隆技术，你每一轮只能克隆一个插入片段。随着实验变得越来越复杂，克隆需要进行许多轮，这样难度系数一下子提高了。不过对In-Fusion无缝克隆来说，多片段克隆仍然是小菜一碟。只要In-Fusion引物设计好，多片段的克隆只需单次反应就能完成。

突变生成
利用In-Fusion技术，你还可以实现定点突变，包括缺失、添加或者替换。你可以设计包含突变位点的引物，并按照操作手册进行实验，轻松获得突变体。

高通量克隆
In-Fusion克隆技术因其简单灵活、结果可靠，也被广泛应用于大规模的高通量克隆。Oxford Protein Production Facility（OPPF）已采用In-Fusion 克隆系统构建了pOPIN vector 重组载体库 。OPPF科学家以703个PCR片段为目的片段成功构建了661重组载体，总体克隆效率可达到94%。文章已发表在Nucleic Acids Research上。

看看别人怎么做

在不少论文中，我们都能看到In-Fusion克隆技术的身影。

CRISPR系统，In-Fusion® HD Cloning Kit应用于Cas9表达载体的构建
CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes
Gilbert LA. et al., Cell, (2013) Jul 18; 154(2):442-451.
 
高通量4分子分析，In-Fusion® HD Cloning Kit应用于质粒库的构建
High-throughput tetrad analysis. Ludlow CL. et al., Nat Methods, (2013) Jul; 10(7):671-675
 
In-Fusion克隆技术应用于抗体可变区的快速克隆、重组单克隆抗体的表达方面
A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. Jones ML, et al., J Immunol Methods, (2010) Feb；354：85-90.
 
In-Fusion克隆技术在目的基因序列中引入点突变
T-box 2, a mediator of Bmp-Smad signaling, induced hyaluronan synthase 2 and Tgfβ 2 expression and endocardial cushion formation. Manabu Shirai, et al., PNAS, (2009) Nov; 106:18604-18609.

听听别人怎么说

无需连接酶的克隆方法：更快速的更准确的选择

“在多次基于连接酶的实验失败之后，第一次使用In-Fusion克隆方法就获得了阳性克隆，甚至在片段GC含量较高和大片段的情况下，也获得成功。”

——美国，威斯康星大学麦迪逊分校，助理研究员，Madhusudan Rajendran
——美国，威斯康星大学，研究生，Ti-Yu Lin

优于连接酶：更高效的单片段和多片段插入反应

“平行比较了使用In-Fusion方法和连接酶方法克隆一个、两个、三个片段。In-Fusion方法远优于连接方法，甚至多片段插入反应时，都显示了非常好的克隆效率。”

——西班牙，巴塞罗那，加泰罗尼亚国际大学，孤儿细胞周期蛋白组，博士后Dr. Samuel Bru

快速直接克隆到大的表达载体

“实验需要表达植物体内定位研究的YFP-标记蛋白质，无需亚克隆，仅仅一个In-Fusion克隆反应，就完成了大的双元载体的构建，成功率达到100%。”

——美国，田纳西州，诺克斯维尔大学，研究生研究助理，Ansul Lokdarshi

选择更丰富，价格更亲民

经过十几年的发展，In-Fusion如今的产品线更加丰富。同时，价格也更加亲民。近日，Takara推出了In-Fusion Cloning的冬日温暖套装，内含In-Fusion和PrimeSTAR两大明星产品，不仅价格优惠，还有无线鼠标赠送。又一次与In-Fusion亲密接触的机会，千万别错过了。

In-Fusion克隆选择
制品名称	Code  No.	In-Fusion  HD附带制品
		纯化用试剂	纯化用Column	高效感受态 细胞	高保真PCR酶
		Cloning Enhancer	NucleoSpin	Stellar™   Competent  Cell	CloneAmp™    HiFi PCR  Premix
In-Fusion® HD Cloning  Kit	639648/49/50	-	-	-	-
In-Fusion® HD Cloning  Kit w/Cloning Enhancer	639633/34/35	√	-	-	-
In-Fusion® HD Cloning  Kit w/NucleoSpin	639639/40/41	-	√	-	-
In-Fusion® HD Cloning  Kit w/Competent  Cells	639642/43/44	-	-	√	-
In-Fusion® HD Cloning  Plus	638909/10/11/20	-	√	√	√
In-Fusion® HD Cloning  Plus  CE	638916/17/18/19	√	-	√	√
In-Fusion® HD Cloning  System	639645/46/47/92	-	√	√	-
In-Fusion® HD Cloning  System  CE	639636/37/38/93	√	-	√	-

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