SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit,助力TCR免疫组库分析

【字体: 时间:2016年12月08日 来源:Takara

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  目前,NGS技术已经越来越多地应用于人类T细胞受体(TCR)多样性的研究。不过,在利用传统方法生成TCR测序文库时,往往只包含TCR可变区的一部分,而且需要用到复杂的多重PCR策略。为此,Takara旗下Clontech近日推出了一个新的解决方案。

目前,NGS技术已经越来越多地应用于人类T细胞受体(TCR)多样性的研究。不过,在利用传统方法生成TCR测序文库时,往往只包含TCR可变区的一部分,而且需要用到复杂的多重PCR策略。为此,Takara旗下Clontech近日推出了一个新的解决方案。

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit为那些利用NGS开展TCR免疫组库分析的研究人员带来了一个强大的方案。它以RNA样本或淋巴细胞作为起始材料,采用类似5’ RACE的策略来捕获TCR转录本中完整的V(D)J可变区。

这个试剂盒接受的RNA起始量很广泛。有研究表明,从外周血白细胞中获得的10 ng至3 μg RNA可产生高质量的测序文库。您甚至可以直接从完整的淋巴细胞开始,用50至10,000个纯化的T细胞制备文库。

顾名思义,这个试剂盒能够产生TCR-α和TCR-β链多样性的数据,这些可以单独获得或同时获得。与以往的多重PCR方法不同,每一轮的文库扩增使用一对引物来扩增每个TCR亚基。制备好的文库已经带有索引,可立即在Illumina平台上测序。

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit利用了Clontech成熟的SMART技术以及Exiqon公司的LNA技术,以无偏向的方式扩增TCR的mRNA序列。首先开展第一链cDNA合成,在合成链的3’端添加一些非模板的核苷酸。之后,SMART-Seq v4 Oligonucleotide与这些核苷酸退火,并作为模板,在第一链cDNA上掺入更多的核苷酸。这也就是模板转换的步骤。掺入的核苷酸,又称为“SMART序列”,将作为后续PCR的引物退火位点,保证只有全长的cDNA经过扩增。

之后是两轮PCR,扩增TCR-α和TCR-β可变区所对应的cDNA序列。第一轮的正向引物与SMART序列互补,而反向引物则有两个,分别对应TCR-α和TCR-β,若需要分析两个TCR亚基,则可同时加入。第二轮PCR则以第一轮的产物为模板,利用半巢式引物扩增整个可变区和部分恒定区。在PCR后,经过纯化、大小选择和定量,文库即可用于测序。


 
图1. SMARTer 法文库构建流程及TCR多样性分析PCR策略

这个试剂盒具有出色的灵敏度和重复性。实验表明,即使样品起始量存在差异,它依然能获得一致的结果。同时,它也实现了低丰度TCR序列的检测。在免疫组库分析上,它也可以助您一臂之力。


 
图2 SMART技术重复性和灵敏度分析。以PBMC RNA样品中分别掺入不同浓度(10%,1%,0.1%,0.01%和0.001%)的同源白血病Jurkat T细胞RNA(TRAV8-4-TRAJ3,TRBV12-3-TRBJ1-2克隆型)为起始,利用SMARTer技术构建文库。对每一个混合文库测序获得的TRBV12-3-TRBJ1-2相关的读段数量通过扣除阴性对照(PMBC RNA)的读段数进行均一化处理。分析表明,SMARTer技术构建的测序文库对不同丰度的特定TCR克隆型的分析是可信、可重复的(Panel A)。利用SMARTer技术构建文库,可以对掺入量为0.1%的Jurkat RNA进行有效测序,证明了SMARTer技术的灵敏性(Panel B)。

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