选对转印膜,Western离成功又进一步[新品推荐]

【字体: 时间:2016年02月24日 来源:生物通

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  为了获得一个漂亮的western blot结果,大家也是蛮拼的。一抗、二抗、封闭、显色,各种优化。唯独转印膜,大家好像不太在意。一般都是实验室里有什么,我就用什么。NC、PVDF,照单全收。殊不知,这小小的一块膜也与最终的结果息息相关。如何选择最合适的转印膜,小编来给你支两招。

为了获得一个漂亮的western blot结果,大家也是蛮拼的。一抗、二抗、封闭、显色,各种优化。唯独转印膜,大家好像不太在意。一般都是实验室里有什么,我就用什么。NC、PVDF,照单全收。殊不知,这小小的一块膜也与最终的结果息息相关。如何选择最合适的转印膜,小编来给你支两招。

NC膜 vs. PVDF膜

硝酸纤维素(NC)膜和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜是western blot中最常用的两种膜。NC膜是最早用于western blot的膜,它的优点在于容易被乙醇溶液润湿,同时产生不错的结果。PVDF膜在1985年被开发出来,在严苛条件下表现出更高的蛋白保留,比如有机溶剂存在时,或者在酸性或碱性条件下。

与NC膜相比,PVDF膜有着更高的机械强度和出色的化学稳定性,因此适合多次剥离(stripping)和反复检测(reprobing)。同时,PVDF膜也有着更高的结合能力。NC膜的典型结合能力是80 μg/cm2,而PVDF膜达到150-160 μg/cm2,这意味它的灵敏度更高。由于PVDF膜的疏水性,它成为疏水蛋白质(如膜蛋白)的首选。也正因为如此,PVDF膜在使用前需要一个简短的甲醇润湿步骤。

PVDF膜也有讲究

看到这里,也许你准备打电话订购PVDF膜了吧,别急,这里面的学问还不少。同样是PVDF膜,它们的性质也有不同。以Pall生命科学的FluoroTrans家族为例,尽管这些PVDF膜都具有高的蛋白结合能力,但它们有着不同的侧重点。

FluoroTrans PVDF膜是为N端蛋白测序而优化的,具有高的吸附能力,高的蛋白保留能力以及对于化学溶剂的抗性。它的孔径约为0.2 µm。固定在FluoroTrans膜上的蛋白不容易被去除,即使是用强烈的离液盐。此外,它的荧光背景极低,适合荧光免疫检测。

若是开展western blot,FluoroTrans W PVDF膜则是不二之选。它有着极高的灵敏度、出色的分辨率,在所有检测系统中都表现出非常低的背景水平。此外,它用结合能力和保留能力上的一点点牺牲,换取了转移过程中极低的蛋白穿透。这种膜的通用性也很好,对10 kD的小蛋白和> 100 kD的大蛋白都适用。因此,你不需要在实验室里准备0.2 µm和0.45 µm两种孔径的膜,只要这一种0.2 µm的膜就够了。

各种包装

转印膜通常以各种包装形式提供,比如FluoroTrans W PVDF膜,Pall就提供了一大卷的膜和各种预切膜。相比之下,一大卷(26 cm x 3.3 m)当然更经济实惠,用多少切多少,不过要麻烦一点。各种大小的预切膜(7 x 9 cm、10 x 15 cm或20 x 20 cm)则省时省力,只是不太省钱。

使用小贴士

BSA通常作为NC膜的封闭液,但是对于PVDF膜,它的封闭效果并不好。因此,Pall建议,在封闭PVDF膜时选用0.5%的酪蛋白(Casein)。具体操作如下:将酪蛋白加入缓冲液中,然后在加热板上加热至80℃或直到溶解;不要煮沸溶液。在使用前冷却至25-40℃。

另外,不要让膜在检测过程中的任何时间点干透,如果膜部分变干,可以让膜完全干掉,然后用甲醇重新润湿,之后用缓冲液浸泡,继续操作。如果你对PVDF膜或western blot过程还有其他问题,欢迎咨询Pall。(生物通 余亮)

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