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CRISPR应用指南:选择哪一种Cas9?[选购宝典]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年3月1日 来源:生物通

摘要:

  CRISPR/Cas9的出现使得人们能够高效地开展精确而靶向的基因组修饰。这其中的关键组分Cas9经过修饰,能够敲除、活化、抑制甚至是成像你感兴趣的基因。不过,目前有这么多种Cas9可供选择,你一定又开始犯愁。别急,让Addgene的专家来帮帮你。

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CRISPR/Cas9的出现使得人们能够高效地开展精确而靶向的基因组修饰。这其中的关键组分Cas9经过修饰,能够敲除、活化、抑制甚至是成像你感兴趣的基因。不过,目前有这么多种Cas9可供选择,你一定又开始犯愁。别急,让Addgene的专家来帮帮你。

首先,让我们来想想实验的目的吧。你希望永久敲除一个基因,还是希望降低特定基因的表达,而并非永久性地修饰基因组?激活特定位点是不是更有意义?还是,修饰表观基因组?这些问题的答案将决定了你的实验需要哪种Cas9。

基因敲除选哪个?

标准的SpCas9

通过共表达目的基因特异的gRNA和核酸内切酶Cas9可创建敲除的细胞或动物。基因组目标可被任何~20个核苷酸的DNA序列靶定,前提是它满足两个条件:1) 序列在基因组中是独特的;2) 目标在间隔相邻基序(PAM)的上游。当基因组中有适合的目标位点,并且不太在意脱靶效应时,SpCas9是合适的选择。

关心特异性?

设计适当的gRNA序列,能增强Cas9介导的切割的特异性。不过,人们也利用多种方法来进一步增强Cas9的特异性。例如,Cas9通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH来产生双链断裂,Cas9-nickase(Cas9n)就利用了这一点。它将两个关键残基中的一个转换成丙氨酸(D10A或H840A),形成了Cas9切刻酶。目标位点上需要两个正确识别的Cas9n分子,才能产生双链断裂,这与野生型SpCas9相比大大增强了特异性。

尽管Cas9n无疑比SpCas9更加特异,但它仍然可能与脱靶位点结合,导致插入缺失。为了克服这个限制,人们使用失去核酸酶活性的Cas9(dCas9),将其与非特异性的内切核酸酶FokI融合。FokI只在二聚化时切割目标DNA。因此,只有当两条dCas9-FokI分子正确靶定目标序列,切割才会发生。

Cas9n或dCas9-FokI方法的一个明显局限在于它们都需要两个适当的目标序列足够靠近,才能有效地产生双链断裂。一些实验室则利用结构生物学来鉴定Cas9切割脱靶位点的关键残基,包括Broad研究院的张锋实验室和麻省总医院的Keith Joung团队。与野生型的SpCas9相比,“增强型Cas9”(张锋)或“高保真Cas9”(Joung)的切割活性相当,但脱靶活性大大降低。

基因活化选哪个?

Cas9的独特之处在于它结合DNA的能力和切割DNA的能力是独立的。换句话说,即使切割DNA的能力被破坏掉,它仍然能够与目标DNA结合。此外,失去核酸酶活性的Cas9(dCas9)可作为一个平台,向特定的DNA位点带去不同的货物。这种特性把各种蛋白带给目的基因,包括转录激活因子和抑制因子。

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