刘明耀、李大力等采用CRISPR纠正血友病突变

　　

生物通报道：最近，华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀教授和李大力教授课题组在《EMBO Molecular Medicine》上发表文章介绍其最新研究成果，他们用CRISPR-Cas技术介导了一个新凝血因子IX基因突变的体细胞纠正，可改善小鼠的血友病。

华东师范大学生命医学研究所、上海市调控生物学重点实验室的刘明耀和李大力教授、海南医学院、南方医科大学的Yanlin Ma，是本文的共同通讯作者。刘明耀和李大力教授带领的课题组，多年来致力于基因编辑修饰方向的研究工作，相继取得了一系列的重要成果，Nature Biotechnology：刘明耀、李大力课题组CRISPR/Cas9基因敲除大、小鼠最新成果；华东师范大学Nature子刊CRISPR新文章；华东师范大学用CRISPR编辑啮齿动物单细胞胚胎。

血友病B（HB），是一种X连锁的遗传性出血障碍，是由凝血因子IX（FIX）缺乏引起的，影响全球每25000到30000男性当中的1人。根据FIX血浆促凝血水平，病情可分为轻度、中毒和重度。因为仅仅增加的血浆FIX水平低至1%就可导致凝血活性的显著恢复，HB被认为是一种很好的模型，用于评估不同基因治疗策略的疗效。

通过重组腺病毒（rAAV）将F9基因cDNA，引入HB动物模型和患者的肝脏（FIX分泌的天然来源），已被证明是有效的，但是仍然存在两大问题：表达的持续时间，以及AAV介导的、向宿主基因组随机插入转基因的安全问题。睡美人转座子诱导的FIX转基因向HB小鼠的随机插入，表明整合到宿主基因组对于长期和高水平的FIX表达，是可行的。

最近的研究表明，通过核酸酶（锌指核酸酶）依赖或独立模式，人类F9 cDNA与小鼠肝细胞内转录高活性的基因组位点之间位点特异性的整合，可成功地改善疾病。这些策略在理论上能够克服对“转基因表达持续时间和随机插入诱导的安全问题”的严重担忧，但是，利用体细胞基因组编辑，通过靶定内源性位点直接纠正F9突变，是否足以恢复凝血活性？尚不明确。

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CRISPR/Cas9是近两年发展起来的一种革命性的基因编辑技术。Cas9/sgRNA可诱导位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），然后开始错误倾向的非同源末端连接（NHEJ）或同源指导的修复（HDR）。之前有研究表明，CRISPR/Cas9系统可用于纠正细胞或小鼠胚胎中的遗传障碍，以及通过破坏PCSK9基因来阻止成年小鼠中的心血管疾病。最近，研究人员通过Cas9介导的体内基因修复，表型上修复了延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）的一个点突变。在这个特殊的模型中，修复后的细胞具有生存优势，并且扩大到当药理抑制剂NTBC被撤回后，取代了突变的肝细胞。因为在模型中最初的正确率低至0.4%，因此，研究Cas9介导的其他遗传疾病的体内基因修复效力，是必不可少的。

在这项研究中，研究人员确定了一个B型血友病患者家族，他们在人类F9基因携带一个新的突变——Y371D。研究人员用CRISPR/Cas9系统来产生不同的转基因小鼠模型，并证实，与先前确定的Y371S突变相比，新的Y371D突变可导致一种更严重的血友病B表型。

为了开发靶定这种突变的治疗策略，研究人员随后对比了裸露的DNA结构与腺病毒载体，传递Cas9成分靶向成年小鼠中的F9 Y371D突变。经过治疗，接受裸DNA结构的血友病B小鼠，在肝细胞中的F9等位基因表现出0.56%以上的修复，这是足以恢复止血作用。相反，该腺病毒载体系统可产生一种更高的修复效率，但是由于严重的肝毒性，没有治疗效果。这项研究表明，CRISPR/CAS介导的原位基因组编辑，可能是人类遗传性疾病的一种可行的治疗策略，然而进一步的临床研究还需要一种有效的和临床相关的传递系统。

（生物通：王英）
注：刘明耀教授1992年获美国马里兰大学细胞生物学博士学位, 1993年到1998年先后在美国约翰-霍普金斯大学医学院神经科学系和加州理工学院生物学部做博士后研究，1999-2007年在美国德克萨斯农工大学生物科学与技术研究所任助理教授，副教授，和终身教授。2007年受聘回国筹建华东师范大学生命医学研究所并任所长，2012年担任生命科学学院院长。刘明耀教授在细胞信号传导、肿瘤发生发展机理研究, 生殖与发育，小分子抗肿瘤及代謝性疾病药物研发等研究领域颇有建树，在国际上享有较高的学术地位，主持多项美国国立卫生研究院研究项目及美国国防部研究项目。入选国家中组部2008年第一批“****”。国家973项目“重要GPCR的结构与功能研究及配体发现”首席科学家，上海市调控生物学重点实验室主任，教育部创新团队带头人。

李大力教授2007年获得美国德州农工大学和湖南师范大学联合培养博士学位，同年受聘于华东师范大学生命科学学院从事教学与科研工作, 于2009 年破格晋升为副教授,2014年破格晋升为研究员。目前为华东师范大学转基因动物中心负责人。2011年开始任上海市调控生物学重点实验室副主任，负责日常工作。近年来在国际知名生物学期刊Nature Biotechnology, Nucleic Acids Research，Development和Endocrinology等杂志上发表研究论文30余篇。主持国家自然科学基金3项，上海市项目1项，同时作为学术骨干参与国家973项目1项，参与省部级课题多项。

生物通推荐原文摘要：
CRISPR/Cas9‐mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse
Abstract：The X‐linked genetic bleeding disorder caused by deficiency of coagulator factor IX, hemophilia B, is a disease ideally suited for gene therapy with genome editing technology. Here, we identify a family with hemophilia B carrying a novel mutation, Y371D, in the human F9 gene. The CRISPR/Cas9 system was used to generate distinct genetically modified mouse models and confirmed that the novel Y371D mutation resulted in a more severe hemophilia B phenotype than the previously identified Y371S mutation. To develop therapeutic strategies targeting this mutation, we subsequently compared naked DNA constructs versus adenoviral vectors to deliver Cas9 components targeting the F9 Y371D mutation in adult mice. After treatment, hemophilia B mice receiving naked DNA constructs exhibited correction of over 0.56% of F9 alleles in hepatocytes, which was sufficient to restore hemostasis. In contrast, the adenoviral delivery system resulted in a higher corrective efficiency but no therapeutic effects due to severe hepatic toxicity. Our studies suggest that CRISPR/Cas‐mediated in situ genome editing could be a feasible therapeutic strategy for human hereditary diseases, although an efficient and clinically relevant delivery system is required for further clinical studies.