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倾听细胞的私语:exosomes研究工具盘点(一)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年3月22日 来源:生物通

摘要:

  大家都知道,细胞不断地向细胞外空间分泌各种囊泡、大分子及小分子。至于分泌哪种类型的囊泡,这要看心情,哦不,要看细胞的来源以及它们目前的状态。近年来,一种微型的囊泡正受到越来越多的关注,这就是exosomes,又称外泌体。

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大家都知道,细胞不断地向细胞外空间分泌各种囊泡、大分子及小分子。至于分泌哪种类型的囊泡,这要看心情,哦不,要看细胞的来源以及它们目前的状态。近年来,一种微型的囊泡正受到越来越多的关注,这就是exosomes,又称外泌体。

这种直径在30至150 nm的小囊泡天然存在于各种体液中,包括血液、唾液、尿液以及母乳。它们像一辆辆小卡车,携带了精心安排的RNA和蛋白货物,在许多生物过程中发挥了不同的作用和功能,比如抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成和炎症等。

其实,在过去很长一段时间内,exosomes一直坐在冷板凳上。人们认为,那些货物不过是些垃圾袋而已。几年前,人们才意识到,exosomes实际上担当了真核细胞之间的通讯作用。核酸是带电荷的分子,无法穿过细胞膜,于是这些囊泡为改变细胞的转录组助下一臂之力。

通俗地说,exosomes就像病毒一样,将内源的遗传物质从一个细胞传递到另一个细胞。以microRNA miR-451为例,肿瘤疯狂地释放miR-451,并将其装入囊泡。当周围的细胞获得这些囊泡,它们就收到了一堆转录本,使得细胞状态更有利于肿瘤生长和血管生成,从而促进了肿瘤的发展。而这仅仅是一个分子。从整体上看,细胞中也有一个社交网络。它们不断交换囊泡,交流大量的信息。

至于细胞间交流了什么,这也是研究人员感兴趣的地方。他们认为,exosomes有望作为生物标志物,用于疾病的诊断和治疗。在此方面,exosomes又格外有吸引力,因为外界的核酸酶和蛋白酶无法破坏它的货物,囊泡内的大分子在一段时间内是稳定的。

当然,我们需要工具,来研究exosomes。几年前,这方面的工具还相当少。随着exosomes研究热潮的涌现,如今我们的选择也越来越多了。

分离exosomes

对于许多研究而言,我们首先要分离出exosomes。经典的方法是超速离心。具体操作是,首先以相对低的速度沉淀样品,去除细胞碎片,然后逐步提高速度,最终以100,000 x g离心1.5小时,以沉淀exosomes。不过,这种方法耗时耗力,也很难标准化,因为各个实验室的转子不同,离心条件不同。这就使得实验室之间的结果几乎没办法比较。而且,并非每个实验室都能用上超速离心机。

好在,市场上出现了多款方便的试剂盒。比如,赛默飞世尔科技推出了几款总exosomes提取试剂盒(Total Exosome Isolation Reagent),能够分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离出完整的exosomes。获取详细资料>>
 
这种新颖的试剂通过捆绑水分子,将溶解度不太高的组分(如囊泡)挤出溶液,从而可通过常规的低速离心来收集。据赛默飞世尔介绍,这几款试剂都采用相同的核心成分,但针对不同的样品分别进行了优化。比如,血浆样品就比血清更具挑战性,因为它含有高水平的凝血因子,不建议将产品混用。

通过这种方法获得的产物包含了全部exosomes,不过对于血清等体液,可能也含有少量共沉淀的其他小囊泡和蛋白分子。对于大多数应用而言,这种纯度已足够,而且它的优势也很明显:流程简单快速,无需特殊设备,可处理少量样品(如100 μl),通量高。

如果你需要更高的纯度,可以使用Dynabeads磁珠来捕获表达CD9、CD63、CD81或EpCam的exosomes。这个额外的步骤无疑将增加操作时间,而exosome的总产量也将降低,但对于那些需要超纯exosomes的项目而言,这是最佳选择。超顺磁的Dynabeads呈浅棕色,因此在整个操作过程中都可以“看见”你的样品。另外,你也可以通过生物素化的抗体和链霉亲和素试剂来富集你感兴趣的亚群。

Exosome Diagnostics公司也开发出一种基于离心柱的简便方法来分离细胞外囊泡(EV),并提取出其中的RNA。目前,基于此技术的商业化产品 – exoEasy Maxi Kit已由QIAGEN推出。

这种方法使用了膜亲和结合步骤来分离exosomes及其他EV。它运用了囊泡的通用生化特性来提取样本中的所有细胞外囊泡,无法通过大小或细胞来源对EV进行区分,也不依赖于是否存在微粒表位。因此,在开始提取前需要对样品进行离心或过滤操作,以便完全去除细胞、细胞碎片、凋亡小体等组分。

整个流程仅仅需要25分钟。将预先过滤的血浆、血清或细胞培养上清与缓冲液混合并结合在exoEasy膜亲和离心柱上。对结合的EV进行洗涤和洗脱,即可用于物理或生化分析。不过,对于生物检测等特定应用,可能需要进行额外的浓缩或缓冲液置换。此步骤可通过孔径尺寸为100 kDa或更小的超滤方法来实现。了解QIAGEN的exosomes提取及分析产品

此外,也有不少研究人员尝试借助超滤膜来纯化exosomes。默克密理博的科学家证实,超滤可作为一种高效的方法,从神经母细胞瘤细胞的培养上清中纯化exosomes。后续的分析证实了exosomes的存在、exosomes特异的CD63表达,并通过Western blotting鉴定出神经元特异的蛋白,包括APP和Tau-1。

对于15 mL以内的样品,利用Amicon® Ultra-15 超滤管(10 kDa MWCO)即可获得优质足量的exosomes。对于200 mL及更大体积的样品,研究人员开发出新方法,利用Stirred cell氮气加压搅拌式超滤杯,仅需1个小时即可完成。具体操作请向默克密理博索取

有了这么多简便易用的产品,分离exosomes不再是难题。下一步呢,就是各种分析了。关于完整exosomes及其携带货物的分析,我们下回再说。(生物通 余亮)

(http://www.ebiotrade.com/)
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