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CRISPR功能研究入门指南(非编码RNA)

【字体: 时间:2016年03月10日 来源:生物通

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  CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR抑制(CRISPRi)特别适合分析非编码RNA的具体功能。最近The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南,帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。

生物通报道:基因组测序让我们意识到,人类基因组只有一小部分被翻译成蛋白质。其实我们基因组的80%会转录成RNA,但这些转录本大多不生成蛋白质。近年来人们发现非编码RNA往往与人类疾病有关,不过绝大多数非编码RNA的功能还是未知的。CRISPR/Cas9在这方面可以起到重要的作用。

CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR抑制(CRISPRi)特别适合分析非编码RNA的具体功能。虽然越来越多的研究人员开始使用CRISPRa和CRISPRi,但它们其实还刚出炉不久。“我们都是这些技术的测试员,”加州大学的Jacob Corn说。

最近The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南,帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。

如何进入细胞

把Cas9蛋白送入细胞并不是一件容易的事,尤其是CRISPRi和CRISPRa中的改良Cas9。对于CRISPRa来说,构建始终表达Cas9或诱导表达Cas9的突变小鼠可以解决这个问题。此外,截短的引导RNA也不难进入小鼠。Konermann发现,14或15bp的引导RNA能包装进病毒(腺相关病毒AAV更好),进而注射到小鼠体内。这种短RNA不能使Cas9剪切DNA,但可以招募转录激活子。

事实上研究者们已经发现了更小的Cas9。过去我们常用的是酿脓链球菌Cas9,其实金黄色葡萄球菌Cas9要小得多,可以包装到AAV并进入细胞。虽然金黄色葡萄球菌Cas9靶标的位点要少一些,但对于转录激活来说这并不是什么大问题,Konermann指出。

测试多少引导RNA

与编辑蛋白编码基因所用的sgRNA(约20nt)相比,研究非编码RNA需要测试更多的sgRNA。Bassett进行基因编辑的时候通常设计三个引导RNA,但在CRISPRi中他会准备5-20个引导RNA。“在转录起始位点前100–200bp的区间中,我会尽可能多的尝试,”他说。预测脱靶效应的计算工具可以帮助我们缩小引导RNA的选择范围。

用CRISPRa研究非编码RNA需要测试的sgRNA就更多了,因为偏爱非编码转录本的sgRNA并不那么好找。“可能我们所知的转录起始位点对非编码RNA来说并不是那么合适,” Konermann说。“也可能非编码RNA就是更难激活。”



非编码RNA研究

CRISPRa和CRISPRi对非编码RNA研究有很大的帮助。不过这些技术都面临着一个问题,非编码RNA(特别是长非编码RNA)往往与蛋白编码基因共享一个调控区域。这个问题很难避免,但并不复杂。我们只需要查一下附近的基因,就可以通过PCR或Western blot检测这些基因的表达,了解它们是否与预定目标一同发生了改变。

虽然CRISPRa和CRISPRi很给力,但我们还需要通过其他途径探索非编码RNA的功能 。举例来说,通过CRISPR基因编辑令非编码转录本失活,有助于验证我们的研究结果。“如果你认为某个长非编码RNA有功能,最好从多种途径来证明这一点,”斯坦福大学的Jens Durruthy-Durruthy说。他在Vittorio Sebastiano实验室从事博士后研究,他所在的研究团队正在使用张锋的CRISPRa和传统的CRISPR基因编辑,研究长非编码RNA在人类发育和癌症中起到的作用。

Weissman的研究团队正在设计新的引导RNA文库,以便更有效地靶标基因组的转录起始位点。O’Connell正在对自己开发的RCas9进行改造。RCas9识别和切割RNA而不是DNA,理论上特别适合非编码RNA的功能研究。不过RCas9最初是在细胞裂解物中使用的,研究人员希望通过改良使其在细胞内有效工作。与此同时,研究者们还在寻找能够直接编辑RNA的天然CRISPR系统,这样的系统将更容易导入细胞。“我相信这样的系统肯定存在,”Bassett说。

去年七月,美国麻省理工的副教授卢冠达(Timothy Lu)在Molecular Cell杂志上发表文章,阐述了一项最新技术在非编码RNA研究领域的应用前景。这篇文章介绍了一个以CRISPR-Cas9为基础的基因组靶向技术,CRISPR-Display (CRISP-Disp)。这一技术是John Rinn博士开发的,能将大片段的非编码RNA送到指定基因组位点。研究人员摸索出的gRNA-ncRNA融合方法,能将非编码RNA带到特定DNA位点,同时不影响dCas9的功能和活性。卢冠达认为,这个系统在合成生物学和非编码RNA机理研究中具有非常大的应用潜力。(更多详细信息参见:卢冠达博士:用CRISPR揭示非编码RNA的秘密

能与指定目标匹配的引导RNA一般不止一条,我们需要为特定基因编辑任务选择最佳的引导RNA。去年七月,哈佛医学院的研究人员开发出了一种预测软件。该软件可以准确找出合适的引导RNA,以最有效的方式实现CRISPR-Cas9基因编辑。这项重要的研究成果发布在《自然方法》(Nature methods)杂志上。(更多详细信息参见:遗传学界大牛Nature子刊发布CRISPR-Cas9新工具

上接:CRISPR功能研究入门指南(CRISPRa)

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生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:Dial It Up, Dial It Down

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