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细胞凋亡检测之选择指南[选购宝典]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年4月18日 来源:生物通

摘要:

  凋亡是个复杂的过程,至少有两种主要途径 – 内在和外在 – 导致了程序性细胞死亡。它们汇集于caspase蛋白酶级联反应,最终破坏重要的细胞蛋白。确定哪条途径被触发,在哪个步骤被阻断,以及抑制剂是否能够抑制,催生了各式各样的凋亡检测。

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当细胞死亡时,研究人员往往会奋力排查死亡原因。他们采用各种分析,来确定细胞是经历了凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis),还是程序性坏死(necroptosis),从而判断特定环境是否有毒,或者确定药物的作用机制。

凋亡是个复杂的过程,至少有两种主要途径 – 内在和外在 – 导致了程序性细胞死亡。它们汇集于caspase蛋白酶级联反应,最终破坏重要的细胞蛋白。确定哪条途径被触发,在哪个步骤被阻断,以及抑制剂是否能够抑制,催生了各式各样的凋亡检测。

它凋亡了吗?

人们以不同的凋亡标志物为基础,开发了通用的凋亡检测,这些产品可单独或联合使用。形态变化,如细胞皱缩和细胞膜起泡,可在显微镜下观察。磷脂酰丝氨酸从内测翻转到细胞膜外侧,则可以通过Annexin V来检测。通过TUNEL检测来标记带切口的DNA,可观察染色体降解。caspase级联反应的激活则通过caspase及其产物的分析来实现。具体选择哪一种,这取决于多个因素,包括细胞类型和样品量、现有的设备和经验。

医生通常并不关心哪些途径或分子被触发或阻断,因为在开药之前,研究工作已经做了。而这些细节正是研究人员想要确定的。

caspase检测

caspase作为酶原,始终存在于细胞中。一些酶,如执行者caspase 3和caspase 7,是组成型的二聚体,必须经过切割和重排,才能形成活性位点。另一些酶,如启动者caspase 8、9和10,是组成型单体,它们只有二聚化并招募到多蛋白复合物之后才激活1。

针对大多数感兴趣的caspase,市场上已经有了抗体。不过,由于caspase是组成型的,必须利用试剂来辨别活性和非活性形式,才能判断它们是否参与了凋亡。抗体这种关键的试剂可用于各种检测,包括流式分析、免疫组化、ELISA、Western blot和免疫荧光。

许多分析检测caspase酶的活性,而不是酶本身。“有一些底物被caspase酶普遍切割,如PARP和核纤层蛋白,而我们有特异针对那些切割产物的抗体,”Cell Signaling Technology(CST)的产品开发专员Gary Kasof说。其他底物只被单个或少数几个caspase切割。

当然,市场上也有并非基于抗体的检测。例如,许多厂商推出了广泛和特定的caspase试剂盒,基于FLICA(荧光标记的caspase抑制剂)检测,其中小小的荧光分子穿过活细胞膜,不可逆地与caspase活性位点结合,而未结合的试剂被洗掉。相同的概念已被用于PET探针,其中F-18 PET标记取代了荧光。

另一个选择是使用一种细胞系,它缺少了你感兴趣的特定caspase基因。“如果研究人员认为,他们已经开发出一种药物,触发了癌细胞的凋亡,那么,这是一种快速而简单的方法,来评估新药是否通过这个途径起作用,”Horizon Discovery的肿瘤项目经理Nicola McCarthy谈道,这家公司提供了一些单倍体caspase敲除产品。

除此之外

“我们也有其他的单倍体细胞系,它们缺失了凋亡途径的各种组分,”McCarthy补充道。

“如果你只是对下游的caspase家族成员感兴趣(这个家族至少有12种独特的caspase蛋白),你将看到几乎所有凋亡途径的融合,”Bio-Rad公司Bio-Plex产品的全球产品经理Daniel Braunschweig说。

不过,如果你只研究caspase,你也许会错过内在途径调控的凋亡。“癌症中缺乏凋亡,而神经退行性疾病或心脏病的过度凋亡,往往是通过Bcl-2家族成员实现的。”基于这个原因,Braunschweig表示,Bio-Rad Bio-Plex(基于Luminex)凋亡产品的重点放在Bcl-2家族。他认为,单一的标志物往往不足以清楚认识凋亡背后的机制。

“每当你想确定一个治疗方案是否起作用,或者给疾病分期,你总是需要多个标志物,”BioVision的技术支持专家Sunetra Ray谈道。也许这解释了流式细胞仪为何在凋亡研究中广泛使用。

对于与凋亡内在和外在途径相互作用的其他分子和通路,人们最近也表现出浓厚的兴趣。这包括凋亡抑制剂(IAP)家族和SMAC(IAP的抑制剂),它们的小分子模拟物已被开发出,以促进癌症中的细胞凋亡。

了解凋亡,有许多方式,从通用的(它是否发生?)到特异的(针对caspase 9和Bax)。你需要仔细选择。它可是关乎细胞生死的问题。

了解Bio-Rad的凋亡检测产品

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

参考文献

[1] Ashkenazi, A, Salvesen, G, “Regulated cell death: signaling and mechanisms,” Annu Rev Cell Dev Biol, 30:337-56, 2014. [PMID: 25150011]

(http://www.ebiotrade.com/)
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