miRNA与癌症:了解它们之间的关联

【字体: 时间:2016年04月21日 来源:生物通

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  如今,研究人员已经鉴定出数千个miRNA,并积极研究它们的生物学,以及它们是否能作为疾病、预后或治疗反应的生物标志物。各种各样的工具也应运而生,协助研究人员更好地了解miRNA的作用。

在肿瘤发生的经典模型中,癌症通过慢慢积累突变、放任细胞增长而发生。许多这样的突变影响关键的调控蛋白,如原癌基因和抑癌基因。不过,非编码RNA基因的突变也同样有害,尤其是microRNA。

microRNA(miRNA)是一类22个核苷酸的调控转录本。它们与mRNA靶点相结合,或抑制其翻译,或诱导其降解。因此,它们也像转录因子一样,影响基因表达。

根据Brigham妇女医院的Sean Lawler在2014年发表的综述,第一个将miRNA与癌症相关联的线索发表于2002年,研究发现慢性淋巴细胞白血病中的miR-15和miR-16缺失,导致它们的靶点BCL2上调。自那时起,人们开始研究miRNA在癌症中的作用。

如今,研究人员已经鉴定出数千个miRNA,并积极研究它们的生物学,以及它们是否能作为疾病、预后或治疗反应的生物标志物。各种各样的工具也应运而生,协助研究人员更好地了解miRNA的作用。

模拟物和抑制剂

大多数的miRNA工具分成两大类:miRNA操控和miRNA表达分析。

操控这一类主要是miRNA模拟物、抑制剂和表达构建体。模拟物和抑制剂是合成分子,顾名思义,模拟miRNA的表达或阻断它们的调控能力。表达构建体让研究人员能通过一个或多个miRNA基因的转录,在靶细胞上施加长期影响。

Dharmacon(现属于GE Healthcare)提供模拟物和抑制剂;这些可通过转染导入细胞。据Dharmacon研发主管Melissa Kelley介绍,研究人员可以在相同条件下、不同的孔中使用模拟物和抑制剂,寻找相反的表型,以便对结果更加自信。

Dharmacon也提供慢病毒表达的模拟物,称为shMIMIC lentiviral microRNA,用于那些无法轻易转染或需要长期活性的细胞。据Kelley介绍,shMIMIC lentiviral microRNA是短的发夹结构,在细胞中表达并被处理成成熟的miRNA,以验证表达特定的miRNA是否能让细胞恢复正常生长。

表达工具

与所有RNA一样,研究人员也可以利用新一代测序(NGS)、芯片、qPCR和原位杂交等方法来定量miRNA。


NGS和芯片撒下了一张最大的网,特别适合探索性的研究,比如确定耐药性的转录特征。这两种方法都带来了全基因组的覆盖度,不过NGS是无假说的,赛默飞世尔科技的TaqMan产品经理Sara Brown如是说。“你可以鉴定之前不知道的新miRNA,但缺点在于流程和价格,以及生物信息学。”

Affymetrix的肿瘤产品销售主管Guy Afseth 则表示,qPCR提供了低成本、灵敏度和通量的优势,特别适合在大量样品中验证候选的miRNA,而ISH让研究人员能够在形态背景下定量转录本。

Affymetrix(现属于赛默飞世尔)提供了两方面的产品,包括GeneChip芯片,以及原位杂交检测(ViewRNA miRNA ISH Cell Assay),能够同时荧光定量1个miRNA和2个mRNA目标。

ViewRNA检测是基于支链DNA杂交方案,将信号强度扩大了8000倍。据Afseth介绍,miRNA的检测方案与其他转录本是相同的,不过由于miRNA很短,探针设置上就缺乏灵活性,这也意味着灵敏度和特异性可能受到影响。

据Affymetrix表达业务部门的销售主管Johanne McGregor介绍,他们目前的miRNA芯片设计(4.0版,基于miRBase 20)不仅包含了miRBase数据库中每个转录本的探针,也包含了其他一些短的非编码RNA的探针,如snoRNA和scaRNA,“让研究人员能更广泛地探索非编码RNA世界”。通过该公司的MyGeneChip™定制芯片项目也可获得定制芯片。

赛默飞世尔为miRNA检测提供了两种类型的qPCR分析。第一代的TaqMan检测利用miRNA特异的茎环结构引物来形成miRNA转录本的DNA拷贝。Brown认为,这在特异性上具有优势,但合成的cDNA不能用于其他miRNA的分析,对于珍贵的临床样本而言,这是个问题。

最近,这家公司推出了基于通用引物的第二代策略,扩增样品中的所有miRNA,即使是那些还未被发现的miRNA。“你只要保存好cDNA,它可用于未来任何miRNA的研究,”Brown说。

如果你想要直接定量体液中的miRNA,那么Abcam的Firefly检测适合你。据Abcam的经理Dan Pregibon介绍,Firefly依赖一系列棒状的水凝胶微粒。每个微粒都带有条形码,可识别特定的miRNA;一个样品中最多可混合70个条形码。

具体过程是,将样品与多个Firefly微粒混合,每个微粒捕获与其互补的miRNA。那些miRNA经过生物素化引物的扩增,再次被微粒捕获,并标上链霉亲和素结合的荧光基团。最后,在流式细胞仪分析微粒,以确定miRNA的种类和丰度。目前,Abcam提供5种预制的Firefly试剂盒,也提供定制产品。

更好的癌症诊断

所有这些工具期望的结果,当然是新的生物标志物和疗法,改变癌症诊断和治疗的过程。截至2014年,至少有20项基于miRNA的临床试验在进行中。不过McGregor认为,miRNA仅仅代表了一类非编码RNA,其他种类的miRNA也发挥了关键的调控作用。“lncRNA、piwiRNA、tRNA – 整个非编码RNA的世界无疑是值得关注的,”她说。

了解Affymetrix的miRNA检测芯片及原位杂交产品

(作者:Jeffrey M. Perkel / 生物通编译)

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