循环肿瘤DNA的研究工具盘点

如果你想要了解个性化治疗的前沿，那么可从非小细胞肺癌（NSCLC）入手。肿瘤学家有多种武器来对付非小细胞肺癌，包括一些针对特定突变的靶向疗法。

据罗氏测序部门的副总裁Lin Wu介绍，若患者的EGFR基因含有某些激活突变，则适合第二代的酪氨酸激酶抑制剂，如Tarceva和Iressa；若患者逐渐对这些疗法产生耐药性，则往往含有不同的突变（T790M），适合第三代的药物，如Tagrisso。“EGFR突变的临床价值是很清楚的，”Wu说。

不过，肿瘤学家首先要获得肺部的活检材料，以此来评估这些突变。这并非易事。肺部活检是痛苦的侵入性操作，大约有25%的患者无法完成。即使获得了，也不能保证这些材料代表了整个肿瘤，尤其是在转移的情况下。在治疗过程中，肿瘤学家肯定不能通过这个来监测治疗效果。

如今，他们有了另一个选择：液体活检。顾名思义，液体活检不使用实体组织，而是从体液中获得生物标志物的信息，如血浆、尿液和脑脊髓液。那些生物标志物有三种来源，其中之一就是无细胞的循环肿瘤DNA（ctDNA）。

Bio-Rad数字生物学中心的科学家Dawne Shelton认为，ctDNA分析让肿瘤学家以前所未有的方式整合肿瘤的遗传学。“每一位肿瘤学家都知道，一小块肿瘤并不能代表全部，更不用说转移，”她说。不过ctDNA涵盖了每个细胞的DNA，即使是那些医生不知道的转移。因此，它带来了更全面的结果：你是否响应这种药物？

当然，这一切的前提是，医生必须真正获得ctDNA。在此，我们来看看你有哪些选择。

ctDNA的纯化

据QIAGEN负责DNA纯化的全球产品经理Marco Polidori介绍，对ctDNA感兴趣的研究人员面临两大挑战。首先，循环DNA非常稀少，只有纳克级，而且不同个体之间往往差异很大。其次，ctDNA总是片段化的。“对DNA或RNA而言，血液是一个恶劣的环境，因此DNA主要由短片段组成，你必须分离这些片段，”Polidori说。

传统的DNA纯化试剂盒往往过滤掉这些短的DNA片段。不过，针对ctDNA的试剂盒，如QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，不这样做。QIAGEN目前提供这个试剂盒的RUO和IVD版本；适用于QIAsymphony自动化平台的第三个版本将在今年晚些时候上市。此试剂盒利用真空装置来处理离心柱，将样品量提高至5 ml，从而增加了灵敏度。

Promega的Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit则是基于磁珠。据全球产品经理Chris Moreland介绍，这个试剂盒一次能够纯化16个样品的ctDNA，而无需用户动手。“用户只需加样到Maxwell cartridge的第一个孔中，并在平板电脑上启动运行即可，”Moreland解释道。“整个过程中没有其他上样步骤，也不需要用户干预。”

若用户想了解他们的纯化和检测效果，可以使用多个厂商提供的参考标准品，包括Horizon Discovery。这些标准品包含片段化的基因组DNA，有三种不同的等位基因频率，可帮助实验室验证及开发他们自己的检测，也能帮助用户确保检测正常运行。Horizon Discovery目前提供两种标准品，一种是多重标准品，含有四个基因的八个变异；另一种是BRAF V600E标准品，适合结肠直肠癌和黑色素瘤研究。

ctDNA的定量

一旦拥有了ctDNA，研究人员需要对它们进行定量。他们通常有两种选择：新一代测序（NGS）或PCR（包括qPCR和dPCR）。

罗氏分子诊断最近推出了cobas® EGFR Mutation Test v2，这是一种多重qPCR检测，能够扫描ctDNA或组织来源的DNA，了解EGFR基因上七个位点的42种不同突变。“cobas EGFR血液检测的分析灵敏度低至10-50个拷贝的突变DNA，具体取决于突变位点，”Wu谈道。

今年4月，Dana-Farber癌症研究所的研究团队利用Bio-Rad的微滴式数字PCR（ddPCR）技术，检测了非小细胞肺癌患者血浆中的EGFR和KRAS突变。他们扫描了180名患者ctDNA中的突变，第一次证明了液体活检技术可成为癌症患者治疗决策中的实用工具。（延伸阅读：JAMA子刊：肺癌液体活检新成果）

Polidori认为，处理ctDNA的研究人员应当意识到两个问题。首先，血液样本必须稳定，比如用QIAGEN的PAXgene ccf DNA收集管，以确保白细胞是完整的。其次，如果你计划用NGS来检测，确保文库制备的方法能够处理极少量的DNA。

尽管存在运输上的困难，但液体活检对QIAGEN而言是一项大产业。“我们看到人们对液体活检的各个方面都有非常浓厚的兴趣，因为它拥有实时监测疾病的希望，”Polidori说。Bio-Rad也是如此。Shelton表示：“我们已经卖出了1000多台仪器；至少一半用于无细胞DNA的工作。这是一个非常受欢迎的应用。”

（作者：Jeffrey M. Perkel / 生物通编译）