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QIAGEN推出快速建库新工具[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年5月25日 来源:生物通

摘要:

  近年来,新一代测序(NGS)技术蓬勃发展,也实现了许多激动人心的应用。然而,尽管NGS技术在不断改进,但文库制备仍然是整个流程中最大的瓶颈之一。它有许多值得吐槽的地方,比如步骤多,耗时长,样品有可能损失,也有可能引入操作误差。

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近年来,新一代测序(NGS)技术蓬勃发展,也实现了许多激动人心的应用。然而,尽管NGS技术在不断改进,但文库制备仍然是整个流程中最大的瓶颈之一。它有许多值得吐槽的地方,比如步骤多,耗时长,样品有可能损失,也有可能引入操作误差。

一般来说,文库制备的流程包括DNA片段化、末端修复、加A尾、接头连接,然后是回收和大小选择。当然,这中间还穿插着许多纯化的步骤。对于珍贵样品或高通量操作而言,这显然是一场噩梦。然而,文库的质量与测序结果息息相关。

第一步的DNA片段化就不能掉以轻心。在这一步中,人们通常利用物理方法(如超声剪切)或酶学方法(即非特异的核酸内切酶处理)将DNA被剪切成小片段。均一的DNA片段化是关键,可帮助获得最佳的文库产量和重复的测序结果。

许多实验室采用Covaris的仪器进行超声剪切。在2015年的ASHG年会上,约翰霍普金斯大学的研究人员发布了一张很有意思的海报。他们评估了两种DNA片段化策略对整体测序结果的影响。在实验中,他们比较了Covaris方法和另一种酶切方法。

他们发现,即使Covaris的DNA片段化带来了一致的结果,但它并不适合高通量的DNA片段化。在Covaris方法中,样品被连续处理,96个样品大约需要10个小时,拉长了整个测序流程。除了时间,这种方法也需要专门的设备和处理管,增加了整体费用。作者总结道,用酶切的方法来取代Covaris,并不会影响测序结果。

既然效果相当,那么酶切的方法显然更加简单易行。QIAGEN最近就推出了QIAseq FX,一个基于酶切片段化的快速NGS文库制备系统,能够在2.5小时内从DNA中获得可立即测序的文库。它省去了各个步骤之间的磁珠纯化步骤,可以节省相当多的时间。另外,方便的多孔板形式和96重的Illumina接头降低了交叉污染的风险,让自动化轻松实现。

这个试剂盒采用FX酶混合液将DNA样品剪切为较小的片段,并开展末端修复,在3’端加A尾,让DNA片段可立即用于连接。它适用于10-1000 ng的起始DNA。若DNA少于10 ng,也不要紧,加入FX Enhancer即可。通过改变QIAseq FX的片段化反应条件可调整片段大小,而具体大小取决于应用和测序读长。整个过程大约在1小时内完成,期间不需要任何纯化步骤。

在这一步之后,测序平台特异的接头可与DNA片段的两端连接。QIAseq FX DNA Library Kit中提供了96重的Illumina 接头板(Adapter Plate)。每孔包含一次性的接头,还带有2个8核苷酸的识别条形码。将8种D5条形码和12种D7条形码组合起来,这个试剂盒支持了96重测序。

如果你的起始材料比较少(< 100 ng),可利用试剂盒中的试剂,开展高保真的扩增步骤。HiFi PCR Master Mix能够均一扩增GC含量迥异的DNA区域,最大限度降低PCR引起的测序偏向,确保在后续的测序实验中获得准确结果。

如今,即使没有专门的设备,只要有了QIAseq FX,也能实现快速、高效的文库制备了。你,是不是也想试试?(生物通 余亮)

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