TUNEL检测选择指南(进阶版)[选购宝典]

【字体: 时间:2016年06月13日 来源:生物通

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  TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的缺口末端标记法)是检测DNA片段化的成熟方法,自1992年首次发表以来经过不断改进,纵横实验室逾20年,至今仍然是广泛采用的凋亡检测方法。如今市场上的TUNEL检测产品有了哪些改进和新选择呢?

细胞凋亡一直都是细胞生物学研究的热点,这个复杂的过程涉及多条通路,可以用多种方法在不同的阶段进行检测。细胞凋亡晚期,细胞核发生形态变化、染色质凝聚、核膜降解、DNA片段化。

TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的缺口末端标记法)是检测DNA片段化的成熟方法,自1992年首次发表以来经过不断改进,纵横实验室逾20年,至今仍然是广泛采用的凋亡检测方法,这是因为TUNEL能够与其他细胞学技术很好的契合。比如,使用TUNEL分析进行凋亡研究有一个好处,研究人员在TUNEL法标记细胞之后,在直接检测和定位凋亡信号的同时,还可以通过抗体在同一个样本上检测细胞表面和细胞内的生物学指标。

TUNEL的基本原理:DNA断裂时会产生大量的粘性3'-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将生物素或荧光素或地高辛标记的dUTP掺入到DNA的3'-末端,可通过一定的显色系统使之显示出来。过去,TUNEL算得上是个值得“用心摸索”的试剂盒,因为有点技术难度。如今市场上的TUNEL检测产品有了哪些改进和新选择呢?

考虑通透性和标记

TUNEL检测的一个关键要素是把握好细胞透化的时间。透化的目的是通透细胞膜和核膜,通俗说就是在膜上打孔,让反应试剂得以充分进入细胞核进行反应,提高检测效果。门开小了大家俬不好进场,若透化不足可能检测不到凋亡的特征,造成假阴性。可开孔太过又影响形态,透化时间太长还容易脱片。

DNA的标记是另一个重要的影响因素。标记分子太大则不利于TdT将其掺入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或荧光素标记,由于荧光基团的“大块头”,使得其标记的dUTP掺入DNA的效率要低于预期。后来改进为利用Br-dUTP来取代生物素或荧光素标记的dUTP,因为溴分子比荧光素、生物素等标记物要小得多,因此Br-dUTP更容易被掺入凋亡细胞的DNA片段中,再经过Br-dUTP抗体识别、以及抗体上偶联的生物素或荧光素放大或显色,使得最后的检测信号也更强。但是,Br-dUTP要用抗体检测,要求严谨的反应条件。

更好的选择是EdUTP,这种以炔烃基团(一种小分子基团)修饰的dUTP比Br-dUTP更小,更容易被TdT掺入到DNA末端。更妙的是,EdUTP的检测不需要经过抗体,而是通过一步高度特异性的click反应(一种铜催化的叠氮化物与炔烃之间的反应),将掺入DNA的EdUTP上的炔烃基团,与叠氮化合物(偶联生物素或荧光素)共价连接,再借助叠氮化物上的生物素或荧光标记,可实现灵敏的TUNEL检测。与BrdU抗体(分子量约为150 kDa)相比,这个叠氮化物的大小仅为1%(分子量<~1000 Da),通透性要好得多。

click技术的优势在于叠氮化物和炔烃都是极小的惰性基团,因此,只需要温和的固定和透化条件,即可达到让试剂充分渗透进入细胞核。同时,高度特异的click反应可实现更低的背景干扰,和更稳定的共价结合产物,从而更好地检测凋亡细胞。此外,升级版的Click-iT Plus技术无需铜的参与,染料兼容性更广泛,在多色检测中表现更出色。


考虑检测方法

TUNEL检测一般采用比色法或荧光法。每一种都有其各自的优缺点,具体选择哪一种,这取决于你的需求以及现有的设备。荧光法可实现多重检测,更为灵敏,不过难以保留信号。由于成像时的光漂白,且随着时间的流逝,荧光信号会逐渐丧失。荧光信号有时也有更高的背景问题,这要取决于组织类型。对于组织切片而言,比色分析允许你开展进一步的形态学分析,并永久记录。

荧光检测

对于组织切片,你可以选择Click-iT Plus TUNEL assay。它采用升级版的Click-iT Plus技术,无需铜的催化,即可让EdUTP与Alexa Fluor甲基吡啶叠氮化物之间发生高度特异的反应,实现灵敏的凋亡细胞检测。经过实验证明,Click-iT技术使得可以采用温和的反应条件,从而保留了细胞的形态以及荧光蛋白(如GFP和RFP)的信号,也能保留以荧光标记的鬼笔环肽染色肌动蛋白的能力,使之能兼容多重荧光检测。

Click-iT Plus TUNEL assay有三种颜色选择,包括Alexa Fluor 488(绿色)、Alexa Fluor 597(橙色)和Alexa Fluor 647(红色)。它含有标记和检测凋亡细胞所需的全部组分,适合FFPE组织切片或在玻片上生长的贴壁细胞。每个试剂盒足够开展50次TUNEL凋亡检测,价格为5742元。

若检测对象是细胞培养物,专为高内涵筛查(HCS)和显微镜成像而优化的Click-iT TUNEL Alexa Fluor™ Imaging Assay是个不错的选择。它具有Click-iT反应的优点,能够快速高效地检测凋亡细胞。整个检测过程可在2小时内完成。此外,Click-iT TUNEL Assay有三种不同颜色可供选择:Alexa Fluor 488(绿色)、Alexa Fluor 597(橙色)和Alexa Fluor 647(红色),允许对细胞表面和细胞内的标志物进行多重检测。每个试剂盒足够检测1块96孔板或50块玻片,价格为10532元。

比色检测

赛默飞世尔最近推出了一款全新的Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒。顾名思义,它也是基于Click-iT技术,采用生物素化的叠氮化物,与掺入DNA的EdUTP“Click”一下,共价结合后,借助生物素与链霉亲和素的亲和反应和信号放大,以及偶联在链霉亲和素上的过氧化物酶以及其底物显色,获得用光学显微镜可检测的暗棕色信号,实现对凋亡细胞进行比色法检测,这可是可以保存以备后续分析的哦。由于反应组分“个头”更小,标记掺入DNA的效果更好,反应组分能更充分渗透进入细胞;再加上Click-iT技术的高度专一能有效降低背景,使得信号更清晰——在凋亡检测之后,利用苏木精或甲基绿等染料进行复染,可以带来更加丰富的内容,让细胞形态、细胞环境及凋亡信号清晰呈现。

这个Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒可检测50份组织或细胞样品,目录价为7200元。不过即日起至9月30日,限时五折,只需3600元即可买到。欢迎尝鲜之后给小编来点反馈!

正如之前所说的,细胞凋亡是一个复杂的过程,仅凭一个TUNEL检测,我们并不能得到让人信服的结果。配合其他凋亡检测产品,你的结果才更有说服力哦。(生物通 余亮)

了解赛默飞的Click-iT TUNEL检测产品及更多凋亡产品

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