上海生科院：用CRISPR靶定DNA去甲基的新方法

在哺乳动物细胞中，DNA甲基化精密地调节基因的表达，从而在许多生理和病理过程中起着举足轻重的作用。近期，来自中科院上海生命科学研究院“****“胡荣贵研究员带领的研究小组，在《Cell Discovery》报道了一种新的方法，采用目前广泛使用的CRISPR-Cas系统来靶定DNA去甲基化。

　　

生物通报道：在哺乳动物细胞中，DNA甲基化精密地调节基因的表达，从而在许多生理和病理过程中起着举足轻重的作用。近期，来自中科院上海生命科学研究院“****“胡荣贵研究员带领的研究小组，在《Cell Discovery》发表题为“A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation”的研究成果，报道了一种新的方法，采用目前广泛使用的CRISPR-Cas系统来靶定DNA去甲基化。点击阅读胡荣贵研究组的更多研究成果：上海生科院发现系统研究蛋白质降解组的新方法；胡荣贵研究组Cancer Cell解析细胞选择性自噬；中科院Cell Res绘制人类蛋白质降解组图谱。

DNA甲基化是向DNA添加甲基的一个后生过程，主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶碱基的第五个碳上。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化调控着基因的表达，从而在无数的生理和病理过程中发挥关键的作用，其中包括，但不限于，细胞发育和分化、基因组印迹和肿瘤发生。通常，肿瘤抑制基因中的DNA甲基化，会沉默它们的表达，并将有助于多种类型的人类癌症。另一方面，DNA甲基化也是许多毁灭性的人类神经肌肉疾病的病因，包括脆性X染色体综合征，其中FMRP的启动子区中三核苷酸重复（CGG）的扩增，可导致基因的超甲基化，并大幅抑制该基因的表达。因此，操纵靶基因DNA甲基化状态的技术进步，不仅有助于我们理解DNA甲基化如何在特定背景下调节基因的表达，而且能控制基因表达，并可能带来有益的临床预后。

最近，有研究发现许多酶能够以不同的机制催化活性的DNA去甲基化。据报道，Tet加双氧酶催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可促使具有Tet催化结构域（Tet-CD）的DNA去甲基化，作为最小的功能模块。研究人员曾尝试利用转录激活因子样效应物-融合的TET1-CD靶定DNA去甲基化，来激活靶基因。然而，它更广泛的作用被限制为基于转录激活因子样效应物的策略，需要繁琐的设计和组装，从而不适合于高通量应用。

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近年来，CRISPR系统已被广泛应用于基因组工程与编辑。利用失活的核酸内切酶Cas9（dCas9），开发的合成生物学平台已经实现了基因调控、基因组编辑或荧光标记。此外，在sgRNA中意外发现的可塑性，可使额外的RNA元件插入形成sgRNA2.0系统。一般而言，这种RNA元件可被许多RNA特异结合蛋白效应物识别，这将可能导致靶向dCas9介导的功能基团的效力放大。

在这项研究中，研究人员报道了一种新的方法，利用CRISPR-Cas9系统，靶定DNA去甲基化。最初，研究人员通过向传统sgRNAs中插入两个拷贝的噬菌体MS2 RNA元件，构建了修改的单导向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），这将有利于Tet1催化结构域（TET CD），与dCas9或MS2外壳蛋白融合，结合到基因位点。

随后，研究人员证明，该系统可显著上调靶基因的转录，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，这与它们邻近的启动子中的CpG的DNA去甲基，是密切相关的。此外，dCas9/sgRNA2.0指导的去甲基化系统，似乎能提供有效的靶基因去甲基化，但是具有脆弱的脱靶效应。该系统的应用，不仅可以帮助我们理解“在具体背景中DNA甲基化如何可以调节基因表达”的机制，而且也使我们能够控制基因表达，并带来潜在的临床益处。

（生物通：王英）

注：胡荣贵，1995年毕业于安徽师范大学生物系获理学学士学位。2000年8月毕业于中国科学院生物化学研究所获理学博士学位。2001年至2006年在加州理工学院生物系蛋白质降解调控研究实验室 从事博士后研究。2006年任加州理工学院生物系Senior Research Fellow。自2006年起获加州再生药物研究所资助研究干细胞发育过程中蛋白质降解系统的调控。2009年7月起，在上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所建立并领导蛋白质降解调控与分子识别研究组，任研究组长。

生物通推荐原文摘要：
A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation
Abstract: In mammalian cells, DNA methylation critically regulates gene expression and thus has pivotal roles in myriad of physiological and pathological processes. Here we report a novel method for targeted DNA demethylation using the widely used clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas system. Initially, modified single guide RNAs (sgRNAs) (sgRNA2.0) were constructed by inserting two copies of bacteriophage MS2 RNA elements into the conventional sgRNAs, which would facilitate the tethering of the Tet1 catalytic domain (Tet-CD), in fusion with dCas9 or MS2 coat proteins, to the targeted gene loci. Subsequently, such system was shown to significantly upregulate transcription of the target genes, including RANKL, MAGEB2 or MMP2, which was in close correlation to DNA demethylation of their neighboring CpGs in the promoters. In addition, the dCas9/sgRNA2.0-directed demethylation system appeared to afford efficient demethylation of the target genes with tenuous off-target effects. Applications of this system would not only help us understand mechanistically how DNA methylation might regulate gene expression in specific contexts, but also enable control of gene expression and functionality with potential clinical benefits.