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NgAgo基因编辑技术之初体验[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年8月8日 来源:生物通

摘要:

  在CRISPR/Cas9之后,DNA指导的核酸内切酶NgAgo又登上基因组编辑的舞台。几个月来,NgAgo经历了大起大落,一开始备受瞩目,最近又备受质疑。英国医学研究理事会(MRC)再生医学中心的Pooran Dewari近日调查了NgAgo技术的使用情况。他认为,这种技术还需要更多时间的优化和发展,才能真正与CRISPR正面交锋。

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在CRISPR/Cas9之后,DNA指导的核酸内切酶NgAgo又登上基因组编辑的舞台。几个月来,NgAgo经历了大起大落,一开始备受瞩目,最近又备受质疑。英国医学研究理事会(MRC)再生医学中心的Pooran Dewari近日调查了NgAgo技术的使用情况。他认为,这种技术还需要更多时间的优化和发展,才能真正与CRISPR正面交锋。

NgAgo的独特之处

Dewari首先介绍了NgAgo为何引人注目。首先,与Cas9不同,NgAgo不需要PAM序列来识别目标,这让研究人员有了前所未有的自由,去靶定DNA中的任何序列。其次,NgAgo的特异性是由DNA指导序列决定的,而不是RNA向导。第三,它能够靶定困难的富含GC区域,这些区域似乎耐受Cas9的切割。

当然,CRISPR/Cas9和NgAgo基因组编辑方法都有自己的优点和缺点。NgAgo DNA向导比较便宜,可自行开展5’-磷酸化或从市场上购买。不过,与RNA向导不同,它不能从质粒中产生。此外,NgAgo/ssDNA的体外组装需要在55°C孵育,这个温度对哺乳动物细胞很危险。在体内,只有新生的NgAgo蛋白可以与ssDNA向导形成复合物。因此,研究人员必须将5’-P-ssDNA向导与NgAgo表达质粒共转染,才能在体内编辑基因。

NgAgo的真实体验

自今年5月首次发表以来,NgAgo技术一直备受关注,而质粒也被全世界的实验室索要了400多次。研究人员都在兴奋地试验NgAgo的基因组编辑应用。他们的进展如何呢?Dewari登陆了NgAgo的谷歌论坛,发现许多研究人员都难以形成插入缺失。于是,他进行了一项调查,询问他们的实验情况,以及与CRISPR/Cas9的比较。

截至2016年8月1日,总共165名研究人员答完了调查问卷。当被问及他们是否能用NgAgo形成插入缺失时,在88名受访者中只有1人证实,在目标位点成功形成了插入缺失。同时,41名受访者试图利用此技术进行表位标记,但只有1人能够在目标位点检测到标记的插入(knock-in)。总的来说,64%的研究人员对新方法不满意,65%的人希望有人能优化NgAgo的操作。绝大多数的受访者(70%)是利用Lipofectamine方法将NgAgo导入细胞的,与最初的文章相同。

Dewari认为,尽管大多数受访者都在努力挣扎着,但这并不意味着NgAgo没有作用。从好的方面来看,少数受访者的确实现了成功的插入缺失和表位插入,这表明NgAgo能在哺乳动物细胞中实现基因组编辑。

然而,大多数研究人员的现状表明,NgAgo系统可能不容易上手。原因之一是所谓的5’-磷酸化ssDNA向导的不稳定性,它可能被细胞机制迅速降解,使得细胞中只有少量的NgAgo/ssDNA复合物。正如原文所提到的,为了实现更好的效果,研究人员需要将ssDNA反复转染。另一个可能的原因是成熟的NgAgo蛋白无法结合ssDNA向导。在翻译过程中,也许只有小部分的新生NgAgo蛋白能够与ssDNA形成有功能的复合物,导致下游的编辑效率不高。

总的来说,Dewari认为我们还需要更多的时间来优化NgAgo,才能得出任何主要结论。他建议从事相关工作的研究人员在谷歌论坛、Twitter或Addgene的博客上讨论,将研究成果与大家分享。基因组编辑领域一直在飞速发展,说不定哪天就有人开发出NgAgo的突变蛋白或全新的核酸内切酶。(生物通 余亮)

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