Covaris自动聚焦超声快速准确鉴定分枝杆菌

传统的菌种鉴定方法往往需要复杂的流程，耗时较长，不利于及时的诊断和治疗。本文介绍了采用Covaris AFA技术与MALDI-TOF技术相结合来进行微生物的快速鉴定，能够大大缩短样本准备的时间，并且提高微生物鉴定的准确度。

分枝杆菌是一种在自然界中普遍存在的放线菌，在空气，水和土壤中均有发现。它可引起免疫功能正常的个体，或是免疫功能受损的个体发生全身或局部的破坏性感染。然而针对不同种类分枝杆菌感染，需要不同的治疗方案。因此菌株的快速准确鉴定，对于诊断及治疗中抗生素的选择非常重要。

 
传统的菌种鉴定方法往往需要复杂的流程，耗时较长，不利于及时的诊断和治疗。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来出现的一种用于微生物鉴定的技术，可以满足微生物快速、准确鉴定与分类的需求，并且操作方法简单。用于微生物鉴定的样本既可以是分离培养的纯菌落, 也可以是原始的临床样本。目前已有许多研究对MADLI-TOF MS的临床应用价值进行了评估。

然而对于分枝杆菌来说，其细胞壁主要是由分枝菌酸，糖脂和其他脂肪酸构成，脂质含量较高，疏水性强，对多肽的提取造成一定的阻碍。目前多肽提取的实验方法缺乏标准化的流程，并且实验步骤复杂，使得完成一次菌株鉴定往往需要1-2个小时。因此在临床的微生物质谱鉴定中，迫切的需要一个更为快速、规范的提取/灭活方法。

Covaris的自动超声聚焦技术(Adaptive Focused Acoustics，AFA)采用远远高于普通超声的频率进行破碎，能量更加集中并且精确可控，能够更加快速的完成分枝杆菌多肽提取，并且具有很高的重复性。本次分享的文章将分枝杆菌的AFA超声提取方法和常规提取方法，在鉴定效果和实验时间方面进行了对比，得出了AFA技术能够显著提高分枝杆菌质谱鉴定的准确度，并大幅提升了检测的速度。

文章中，作者首先使用AFA聚焦超声方法以及传统方法对已知种类的分枝杆菌样本进行破碎提取，并采用MALDI-TOF MS进行微生物质谱鉴定。然后将鉴定得到的数据与已知菌种的标准数据进行比对得到置信度评分。通常log≥1.7时，可以认为待测样品质谱数据和已知样品的质谱数据一致，并且数值越大，数据可信度越高。结果显示，利用AFA技术提取后进行质谱鉴定，所得到的置信度平均得分的log值为2.07(1.90-2.26)，而传统方法提取后进行质谱鉴定，得到的平均得分的log值为1.96(1.52-2.20)。并且，以置信度得分log≥2.0作为cut-off，AFA鉴定的准确率为66.7%，传统方法为41.7%；当分别以log≥1.8和log≥1.7作为cut-off时，传统方法的准确率为66.7%和83.3%，而AFA方法鉴定的准确率为100%。
（注：得分表示样品的质谱图谱与数据库中已知样品的图谱的相似程度，log值越高，表明待测样品的细菌蛋白质鉴定的灵敏性和准确度越高）

 
同时作者还发现，使用AFA技术进行提取的菌株，在鉴定时的重复性也远远高于传统的提取方法。具体表现为，在以log≥1.7作为cut-off时，AFA提取样品2-4个重复点鉴定的一致性为100%，而传统方法鉴定需要4个点的重复才能达到77.5%的一致性，2个点重复时仅有38.3%。

 
在实际临床样本的测试中发现，在不改变原有质谱数据库的情况下，AFA方法可以正确鉴定出83.4%的分枝杆菌种类(log≥1.7)，如果使用AFA质谱鉴定的数据对现有数据库进行补充可以显著提高菌种鉴定的准确度。

不仅如此，在加快鉴定流程方面，AFA聚焦超声技术也表现出了明显的优势。具体表现为，使用AFA技术处理每个样本的平均只需要4.5分钟，而传统方法则需要95.5分钟。仅从菌株灭活步骤来看，传统方法就需要30分钟，而运用AFA技术仅需2分钟即可将分枝杆菌有效灭活。

综上所述，Covaris AFA技术在分枝杆菌的质谱鉴定方面，可以提供高效、快速的样本处理方式，并且能够促进微生物质谱鉴定得到一致性、并且准确的结果。AFA技术操作简单，运行参数可以精确控制，能够充分保证实验的重复性、标准化以及规模化。

 
原文

La’Tonzia, L. Adams, et al. "A Rapid Standardized Protein Extraction Method Using Adaptive Focused Acoustics for Identification of Mycobacteria by MALDI-ToF MS." Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (2016). http://www.dmidjournal.com/article/S0732-8893(16)30161-4/fulltext

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