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Cas9 转录激活:实用操作指南[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年9月22日 来源:生物通

摘要:

  近年来,CRISPR/Cas9系统被广泛应用,最初是用于基因编辑,如今也用于转录激活。将核酸酶失活的Cas9与转录激活结构域相融合,人们能够上调几乎所有基因。在Addgene的博客上,哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的Marcelle Tuttle和Alex Chavez就针对这一操作提出了一些实用的建议。

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近年来,CRISPR/Cas9系统被广泛应用,最初是用于基因编辑,如今也用于转录激活。将核酸酶失活的Cas9与转录激活结构域相融合,人们能够上调几乎所有基因。在Addgene的博客上,哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的Marcelle Tuttle和Alex Chavez就针对这一操作提出了一些实用的建议。

何时使用

Cas9激活物的最佳用途之一是基因筛选。利用寡核苷酸文库合成,可轻松获得靶定人类基因组中每个基因的gRNA。在此之前,利用其他的DNA结合蛋白也曾获得类似的工具,如锌指(ZF)和TAL效应物(TALE)。与它们不同的是,Cas9可轻松改变所靶定的序列,你只需要准备一个新的gRNA,而不需要一个全新的蛋白。这让Cas9激活物更加经济。

你可能会说,cDNA文库的作用也差不多啊,它包含的质粒可以过表达特定细胞类型的编码序列。不过,与gRNA相比,这些文库难以构建和导入。此外,cDNA不能用于顺式调控的研究,也无法轻松导入特定基因的异构体,因为很多时候,特定细胞中的异构体是未知的。而Cas9激活物在天然背景下激活基因,能有效解决这些问题。

优点

缺点

Cas9激活物

·         容易导入

·         适合全基因组筛选

·         生成适当的基因异构体

·         可观察顺式调控

·         需要花时间来验证试剂

·         导入更多试剂

·         一些基因不容易激活

cDNA文库

·         常用方法

·         不大需要验证

·         市场上有现成的cDNA文库

·         使用较为困难

·         只能导入单个异构体

·         无法观察顺式调控

清醒认识

不过,你需要知道,尽管Cas9激活物是一种十分强大的工具,但未必适合每种应用。举个例子,如果你只想激活单个基因,那么Cas9激活物也许不是一个好的选择,因为有多个因素可能阻止你的基因被上调。比如,在天然条件下基因的表达量越高,利用Cas9可实现的激活就越少。你的基因可能已经达到激活的上限,那么Cas9也帮不了你。此外,激活实验往往需要大量的调整。对于你想要激活的每个基因,你需要准备3-4个向导RNA,因为它们的效果可能大相径庭。

当然,如果将Cas9激活物用于大规模的全基因组筛选,这几乎不成问题,因为若基因不能正确上调,充其量是错过一个,而不是整个实验失败。因此,当用户想要激活单个基因时,Tuttle和Chavez建议使用cDNA过表达载体,而不是浪费很多时间来做Cas9的troubleshooting。

最后,专家指出,尽管Cas9激活物在体外实验中非常有用,但这种技术还未用于体内实验。大多数Cas9激活物比较大,难以放入最常用的载体 – 腺相关病毒(AAV)中。不过,未来更小的Ca9同源物和转录因子有可能与AAV兼容,同时保留了诱导基因表达的能力。

选择哪种激活物?

目前有许多种激活物可用在你的实验中。面对林林总总的选择,你可能有点犯愁。专家表示,对于多个细胞系(HEK293T、MCF7、U2-OS、Hala、N2A、3T3)和生物,SAM、Suntag和VPR都是不错的选择。他们的建议是,选择你最常用的,选择你最熟悉的。

至于脱靶效应,这在Cas9激活物中通常不被认为是个大问题。之前的RNA-Seq实验也证实,Cas9脱靶跑到另一个基因的启动子上的几率非常低。话虽这么说,Tuttle和Chavez通常还是将基因的启动子放入gRNA finder中(如WU-CRISPR或sgRNA scorer 1.0),从中挑选出最接近转录起始位点(TSS)的向导RNA。他们建议让sgRNA靶定TSS上游200 bp内的区域,这样结果最好,不过400 bp以内的区域也不错。

最后,专家们祝你好运!(生物通 余亮)

(http://www.ebiotrade.com/)
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