还在为微量样本制备发愁？ 让Covaris为你分忧！

传统的样本匀浆方法，无法做到完全充分的目标分子释放，尤其是样本来源稀少时，如何进行样本处理对于下游的实验结果与分析会造成决定性的影响。本文介绍了基于Covaris AFA聚焦超声处理方法对少量样本处理，与传统方法对大量样本处理的结果进行蛋白组分鉴定。Covaris AFA辅助蛋白提取、还原、烷基化和消解，以及PLOT-LC-MS串联质谱鉴定联合使用，可以高效的对少量细胞进行分析。

2016年8月3日，科技部发表了《‘精准医学研究’重点专项2017年度项目申报指南建议》。建议中『新一代临床用生命组学技术的研发』章节，定量蛋白质组鉴定分析技术部分指出，要实现100到1万个细胞以及纳克级超微量的蛋白质组学分析。

我们都知道，DNA、RNA以及蛋白质等生物大分子多数存在于组织细胞内，而要对这些生物大分子进行分析，势必要经过样本制备和提取的过程。常用的制备方法有裂解、研磨、匀浆等等，但有时这些方法并不能充分破碎样本，往往会导致目的分子释放不充分，而当样本量较小时，常规提取方法又容易造成生物大分子的损失。

然而运用Covaris的自动声波聚焦（Adaptive Focused Acoustics，AFA）技术，则能够将组织、细胞等匀浆破碎成微米甚至是纳米级大小的颗粒，从而使得各种目标分子充分释放。

Adaptive Focused Acoustics™ (AFA)

今天我们就结合一篇从血液样本中分离提取特定细胞的文章，看一下Covaris在微量样本提取中的出色表现。

血液、体液及组织样本中稀有细胞的分离鉴定在临床诊断和个性化治疗过程中有巨大潜力（比如循环肿瘤细胞和干细胞）。文章的研究对象为血液，虽然血液中细胞类型丰富，但一般来说血液样本可以获取的总量有限，因此，目的细胞的高效分离与提取是实验成功的关键。

在细胞分离方面，文章使用了微流控磁泳的方式对细胞进行富集。通过人为将已知数量的MCF-7细胞与血液混合并进行磁泳富集，结果显示微流控磁泳富集的效率可达90%以上。

 

虽然富集效率比较高，但细胞总量过低依然是蛋白提取的限制因素。如果使用传统方法进行小样本量样本提取，由于溶液转移以及接触表面的损失，会大大降低可鉴定出的蛋白种类（损失5-10倍）。即便使用针对少量细胞优化的提取方法（变性剂辅助裂解、丙酮沉淀等），提取后可鉴定出的蛋白种类依然比较低，通常仅能鉴定到几百种蛋白。

因此，文章选用了Covaris超声破碎的方法进行提取。得益于Covaris使用的AFA(自动声波聚焦)技术，可使用非去污剂法进行辅助蛋白提取，并且后续还原、烷基化、蛋白消解等均可在同一样本管中完成，大大减少蛋白损失，提高产率。

下图是分别以Covaris提取2000个细胞和常规方法提取1×10^7个细胞得到的蛋白中取出等量细胞蛋白产物(等效于500个细胞)进行PLOT-LC-MS串联质谱鉴定的结果(n=3)。可以看出，采用Covaris对2000个细胞进行提取时，蛋白损失非常少，接近于常规方法提取1x10^7个细胞的效果。

 
而当上样量进一步降低时，采用传统提取方法可鉴定的蛋白数量迅速降低，而采用Covaris提取方法鉴定出的蛋白数量降低不明显，并且出现了反超，这也说明Covaris对微量样本的处理更加均匀，损失更少。

 
随后，文章使用该方法对血液样本中天然CD133+细胞进行富集与鉴定。下图中分别是使用CD133抗体对正常血液样本中的HSC（造血干细胞）和EPC（内皮祖细胞）细胞进行富集后，采用流式细胞仪对富集得到的细胞进行类群分析的结果（EPC：CD34+/CD45-/KDR+； HSC：CD34+/CD45+/KDR+），以及每个个体两次重复取样的质谱鉴定结果。

 

综上所述，通过微流控磁泳分选细胞，Covaris超声辅助蛋白提取、还原、烷基化和消解，以及PLOT-LC-MS串联质谱鉴定联合使用，可以高效的对少量细胞进行分析，只需100-200个细胞的上样量即可鉴定出超过4000种蛋白质，是以往方法处理效率的5-10倍。得益于高效的样本处理体系，深度蛋白组分析所需的血液样本量降低了1-2个数量级。因此，Covaris 的AFA技术在样本制备，特别是微量样本的制备中起着非常重要的作用。

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原文出处

Li S, Plouffe B D, Belov A M, et al. An integrated platform for isolation, processing, and mass spectrometry-based proteomic profiling of rare cells in whole blood[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14(6): 1672-1683.

http://www.mcponline.org/content/14/6/1672.long