Western Blot一定要用看家蛋白做内参?NO!还可以是总蛋白

【字体: 时间:2016年09月27日 来源:基因有限公司

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  期刊杂志对Western Blot文章发表的要求越来越严,这些要求包括如何确保Western Blot的重复性、定量的准确性、均一化方法的选择等。Nature、JCB、JBC等杂志明确规定Western Blot进行均一化时,要求选择不受实验条件影响的方法;JBC甚至还建议优先选择总蛋白进行均一化。今天基因小编就对Western Blot均一化方法做一简单总结与分析。

  

什么是均一化呢?

Western Blot均一化是指:将目标蛋白信号÷上样对照信号得到均一化的数据,以此来校正不同样本之间、不同泳道之间的差异,以获得准确、可重复的Western Blot的结果。上样对照一般是稳定表达的内参蛋白,表达量不受环境、实验处理的影响。

均一化校正的是什么呢?

为什么要进行均一化呢?

均一化校正了样本之间的差异,保证了Western Blot检测到的数据是目标蛋白真实的数据。如果没有进行合适的均一化,不能确保获取的实验数据是真实的生物学差异还是实验导致的误差(如图一所示)。

图一:均一化校正了样本之间的差异,保证了Western Blot 检测到的数据是真实的生物差异而不是实验导致的误差。A图:未进行均一化的数据显示目标蛋白(红色)表达量差异较大,样本四表达量最低;B图:经内参蛋白(绿色)均一化后数据显示,样本之间蛋白表达量差异很小。

有哪些均一化方法呢?

比较经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化,看家蛋白又称管家蛋白,一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响,主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等,但是进一步的研究表明,在某些实验条件下,看家基因的表达会因不同类型的组织、不同的发育阶段、或不同的实验条件而变化。另外,用看家蛋白进行均一化需要注意信号饱和的问题,因为一般情况下看家基因表达丰度相对于目标蛋白丰度较高,两种蛋白可能存在不同的线性范围,为此实验人员往往需要调整上样量。因此为了确保更准确、客观的的均一化方法,有些研究人员、期刊杂志建议用总蛋白做Western Blot的均一化。

总蛋白染色---REVERT™ Total Protein Stain

总蛋白均一化是利用染料对胶上/膜上的总蛋白染色进行均一化,主要包括以下几种类型:不可逆结合染料法:如考马斯亮蓝染色法、Stain Free法等;可逆结合染料法:REVERT™ Total Protein Stain总蛋白染色法。考马斯亮蓝染色法操作简单但往往需要同时跑两块胶,一块胶进行染色另一块胶进行后续免疫试验,因为是对胶进行染色所以存在不能校正转印差异的问题;Stain Free等染料不可逆共价结合蛋白法,是对胶上或膜上总蛋白进行染色,由于与蛋白是共价不可逆结合,因此可能会影响抗体与靶蛋白的结合,并且在膜上的背景较高、线性范围也比较窄;LI-COR REVERT™ Total Protein Stain方法是对膜上总蛋白进行染色,因为是可逆结合所以不会影响后续抗体结合,不干扰Western Blot的检测,而且是在近红外波段成像背景较低,灵敏度较高,因此能够校正Western Blot的所有步骤,适用于任何生物条件下的实验,成像结果见图二。

哪种均一化方法最好?

没有哪一种均一化方法是最好的,因此需要了解每一种方法的特点以便选择一种符合您实验目的、生物学条件的均一化方法,以校正不同样本之间的差异,带给您准确、可重复、可发表的高质量数据。无论您选用哪种均一化方法,LI-COR Odyssey 近红外激光成像系统都能提供准确的结果。

基因有限公司作为LI-COR产品中国区独家代理,邀请您一同关注近红外荧光成像技术在WB准确定量、磷酸化等蛋白修饰化研究、In-Cell-Western、双色EMSA、蛋白芯片及光免疫疗法等方面的应用进展。欲进一步了解详细内容,请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司工作人员。

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