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扫盲贴:如何评估NGS文库的质量?[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2016年9月29日 来源:生物通

摘要:

  NGS文库制备的目标是在DNA或cDNA片段上连接厂家特异的接头,让它们能够在NGS平台上测序。这个概念似乎非常简单,不过实现这个目标可比你想象的要复杂得多,而只有严格的质量控制才能确保最佳的结果。近日,QIAGEN的产品专家Verena Schramm就介绍了这一过程。

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NGS文库制备的目标是在DNA或cDNA片段上连接厂家特异的接头,让它们能够在NGS平台上测序。这个概念似乎非常简单,不过实现这个目标可比你想象的要复杂得多,而只有严格的质量控制才能确保最佳的结果。近日,QIAGEN的产品专家Verena Schramm就介绍了这一过程。

她认为,成功测序的两个决定因素是文库材料的质量和数量。评估片段的大小分布以及文库的准确浓度是两个关键的参数,可帮助你评估文库的质量。除了这两个标准的质量指标,下面还有一个重要指标,可帮助你判断文库制备的整体质量。

转化率

转化率指的是有多少起始分子被转化成“可测序的”片段,或者两端加上接头的片段。一种简单的计算方法是将测得的文库产量除以理论的最高产量。在计算过程中,PCR的扩增效率和纯化过程中的损失必须考虑进去。此外,我们还要考虑到,qPCR文库定量方法不能区分特异文库和接头二聚体,不适合接头二聚体浓度高的片段。对于这种文库,建议使用电泳方法来定量,如QIAGEN的QIAxcel或安捷伦的Bioanalyzer。

例如,假设PCR扩增效率为95%,而纯化过程损失20%的样品,那么理论上的最高产量如下:

转化率的定义为测得产量与理论最高产量之间的比值。它在很大程度上受到连接效率的影响。因此,对于好的文库制备试剂,它的酶和缓冲液配方必须经过优化,以确保连接效率最高。

复杂度

在文库制备过程中,若转化率高,偏向性少,则能从样品中捕获更多独特的分子。更多独特分子被测序,这意味着数据集中的重复读取更少。重复读取不能带来有意义的信息,可能导致变异频率改变。因此,在数据分析时需要去除重复读取。

确定复杂度的另一个重要因素是文库制备的样品量。样品量越低,NGS文库的复杂程度就越低。因此,对于低于纳克级的样品,高的连接效率和转化率是尤为重要的,这才能尽可能地捕获有限样品中的最大复杂度。

均一性

覆盖均一性指的是读取在基因组或目标区域内的分布均一程度。覆盖越均匀,达到特定深度所需的测序就越少。覆盖均一性的偏向通常是在文库制备和文库扩增步骤中引入的。在很多时候,覆盖均一性表现出明显的GC偏向,也就是说,覆盖更少或更多,这取决于GC含量。

准确性

NGS文库制备的准确性越高,你对变异报告的信任程度就越高。核苷酸错误通常在PCR扩增以及测序过程中引入。测序错误通常低于1%。通过使用高保真PCR试剂,可尽量减少文库扩增的错误。NGS对照样品也有助于评估NGS流程的准确性。

在文库制备过程中,这些关键的质量指标都必须考虑,才能获得更好的结果。如有兴趣,可了解QIAGEN的QIAseq NGS产品组合。(生物通 余亮)

(http://www.ebiotrade.com/)
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