三篇Molecular Cell文章：CRISPR技术工具包

　　

生物通报道：在基因组编辑的世界里，CRISPR/Cas9代表着王牌。它为研究人员带来了一种简单的方法，将核酸酶、转录调控因子或荧光蛋白送到基因组中的任何地址。这种方法已改变了疾病研究、基因调控、药物开发等，因此也成为了一大研究热点。

近期Cell出版社旗下两大期刊：Cell Stem Cell与Molecular Cell杂志联合发布了CRISPR专刊，从CRISPR与表观遗传学，CRISPR与人类基因组编辑，CRISPR对抗系统，CRISPR工具箱，真核生物基因组CRISPR技术与方法，以及CRISPR高通量研究方法等7个方面进行了介绍。

上篇：两份Cell子刊联合发布CRISPR专刊：七篇文章CRISPR的最新前沿

CRISPR-Cas工具包

CRISPR-Cas系统本来是用于保护原核生物免受噬菌体和其它游离遗传因素的侵害，现在已经发展成为基因工程革命性工具。

II类CRISPR-Cas系统采用的是与导向RNAs匹配的单个个Cas核酸内切酶，来切割互补的核酸靶标，通过最少的机械变动实现可编程序列特异性靶向。近期针对过去不清楚的CRISPR-Cas系统的研究，已经揭示了这一生物技术工具在除了II型Cas9系统以外的更多工具。

“The Revolution Continues: Newly Discovered Systems Expand the CRISPR-Cas Toolkit”这篇综述回顾了目前针对新发现单蛋白Cas内切酶的机制研究，指出更多的多样性进一步扩充了CRISPR-Cas生物技术工具包，有助于基于各种Cas内切酶活性诊断工具的广泛应用。这些进展指出了了基于不断扩大的CRISPR-Cas系统令人兴奋的前景。

Nature，Cell两篇文章发现CRISPR新系统的奥秘

Nature打破技术限制：CRISPRa截然不同的非编码调控序列分析技术

中科院学者Cell文章：CRISPR-Cas系统研究重大突破

真核基因组中的CRISPR技术及其应用

过去几年来，CRISPR-Cas9系统的应用从高效的基因组编辑到高通量筛选，再到一系列的DNA和染色质修饰酶的发现，带来了这一研究领域爆炸式的发展。

CRISPR/Cas9系统在进行基因组编辑时，内切酶Cas9会在gRNA的指导下引入位点特异性的双链断裂。然后细胞利用寡核苷酸与目的位点的同源重组进行修复，最终实现对基因组特定位点的改写。细胞主要通过两种途径来修复这样的损伤，非同源性末端接合（NHEJ）和同源介导修复（HDR），CRISPR/Cas9主要依赖于同源介导修复。同源介导修复比非同源性末端接合的效率低很多，大大影响了CRISPR/Cas9的编辑效果，阻碍了这一技术的广泛应用。

为此，许多研究者尝试通过增强HDR的效率来实现精确的基因修饰。比如德国MDC研究所的研究人员通过多种途径对NHEJ通路进行抑制，最终成功提升了CRISPR-Cas9在哺乳动物细胞中的基因编辑效率。

KU70、KU80和DNA连接酶IV是NHEJ通路中的关键分子。为了靶标这些分子，Ralf Kühn和Klaus Rajewsky领导研究团队进行了基因沉默，使用了DNA连接酶IV抑制剂（SCR7），还表达了腺病毒蛋白（E1B55K和E4orf6）。

研究显示，抑制KU70和DNA连接酶IV能够将HDR的效率提高四到五倍。而腺病毒蛋白与Cas9系统共表达时，人类和小鼠细胞系中的HDR效率提高了八倍，且基本去除了NHEJ活性。

还有Whitehead研究所的研究人员也提出了一个通过抑制NHEJ完善CRISPR/Cas系统的方案。他们在对受精卵进行基因编辑的同时使用了一种抗癌药物Scr7，Scr7能结合DNA连接酶I进而阻断NHEJ修复通路。他们的这项研究将CRISPR/Cas的效率提高了19倍。研究人员指出，这一技术将改变人们构建转基因小鼠的方式，加快研究的速度，并且获得更为复杂的变异。（Nature技术突破：将CRISPR效率提高19倍）

高通量方法确定非编码基因组区域的功能

CRISPR-Cas系统是基因组编辑的强大工具，其简单的可编程性使得这一技术在高通量遗传和表观遗传学研究中如鱼得水。

今年上半年，来自杜克大学的一组研究人员研发出了一种新工具，通过CRISPR-Cas9表观基因组编辑方法提出了一种高通量筛选技术，识别出了人类细胞基因组中的调控元件。

研究人员将两种形式的Cas9蛋白（dCas9）引入到这一细胞系中（dCas9具有失活的核酸酶活性）：dCas9抑制形式能召集蛋白，令组蛋白H3中赖氨酸9位置甲基化，从而导致靶序列中的异染色质形成和基因抑制；dCas9激活剂形式能结合到靶向DNA增强子或启动子上，促进组蛋白H3上赖氨酸27的乙酰化，导致基因激活。

接下来，研究人员将低水平导向RNA文库转入细胞系中，确保每个细胞中都有一个导向RNA，之后通过荧光对细胞进行分选，并对细胞中的导向RNA进行测序，尤其是哪些具有特别高或者特别低靶基因表达水平的细胞。

序列检测证实了之前已知的调节元件，也揭示了其它DNA序列的新作用。尽管不是全部序列，但大多数序列都出现在了激活和抑制物筛选中了。研究人员发现一些序列似乎在一种细胞类型的基因调控中扮演了重要的角色，但对其它细胞类型的同样基因没有影响。虽然目前观察到的基因表达变化很微妙，但研究人员证实了个体DNA序列的调控作用。CRISPR筛选发现非编码DNA的调控功能

（生物通：万纹）

原文标题：

The Revolution Continues: Newly Discovered Systems Expand the CRISPR-Cas Toolkit

Methods and Applications of CRISPR-Mediated Base Editing in Eukaryotic Genomes

High-Throughput Approaches to Pinpoint Function within the Noncoding Genome