跟着文献做实验：选择合适的全基因组扩增产品

宏基因组鸟枪法测序是探索微生物群落的强大工具。在临床微生物学领域，它正受到越来越多的关注。这种方法不仅能鉴定病原体，还能预测耐药性，协助流行病学研究等。不过，研究人员有时会遭遇DNA太少的尴尬，比如面对无法培养的细菌，或开展单细胞分析。这时，全基因组扩增（WGA）就可以派上大用场。

全基因组扩增指的是通过各种方法扩增生物体中的全部DNA内容，这一环节所使用的扩增方法及其效果显得尤为重要。理想状态下，全基因组扩增需要最大程度降低不同区域扩增效率的偏倚，特别是对于具有特殊GC含量以及复杂基因组结构的区域。此外，在通过长期的一些研究发现， 通常所使用的WGA试剂存在着污染DNA存在的可能，对于实验结果的可信度造成了巨大的负面影响。

为此，在最近发表的一篇研究文献中，来自梅奥诊所等机构的研究人员评估了三款市售的WGA试剂盒，以鉴定污染DNA的相对量和组成。这三款试剂盒分别为：Illustra V2 Genomiphi kit、Illustra single cell Genomiphi kit和QIAGEN REPLI-g single cell kit。他们希望选择出适当的WGA试剂盒来协助临床上的诊断。

在这项研究中，他们的研究对象是假体关节感染，此病是人工关节置换术后最严重的并发症，会对个体造成严重后果，因为通常需要多次手术和长期注射抗生素才能治愈。治疗方法取决于鉴定出的病原体，不过在20%的病例中，使用常规技术检测不到病原体。因此，宏基因组测序成为了解决这一问题的一大利器。

通过去除了样本中的人类DNA成分后，研究人员利用三款试剂盒来对于相同样本中细菌DNA进行扩增，并通过两种分析工具来确定细菌DNA的组成及含量。他们发现，Illustra single cell Genomiphi kit始终产生最少量的细菌背景reads数。不过，培养后鉴定出的病原体reads数也比较少。与之相比，QIAGEN REPLI-g kit和Illustra V2 kit鉴定出的病原体数量分别为42倍和141倍。他们还发现，在这三个试剂盒中，污染的细菌DNA产生reads数最多的试剂盒是Illustra V2 kit。通过Livermore宏基因组学分析工具（LMAT）鉴定，这些读取来自假单胞菌属、丙酸杆菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属等。另一种分析工具MetaPhlan2也获得了类似的结果。

通过更为全面的比较，研究人员认为QIAGEN REPLI-g single cell kit在这一过程中实现了最佳平衡，结果中背景reads比Illustra V2 kit少，而实际有效的病原体reads数比Illustra single cell kit多。同时，在大多数样本中REPLI-g试剂盒带来了最高比例的病原体与非病原体微生物reads数。

总体而言，这项研究成果不仅突出了WGA本身对临床感染的宏基因组分析的影响，也凸显了试剂盒选择带来的显著影响，包括观察到的背景DNA污染，以及已知病原体的相对reads数量。由此可见，在选择WGA试剂盒时必须谨慎，以免大大影响实验结果的可信度。

基因组复印机

其实，QIAGEN的REPLI-g试剂盒作为单细胞扩增的金标准方法，一直广泛受到全基因组扩增人士的青睐，人们称之为“基因组复印机”。这个系列包括多款试剂盒，适用于不同的样本和起始量，都采用经QIAGEN反复优化的多重置换扩增技术对全基因组或转录组进行无偏差的扩增，并已在多个研究领域实现了十分广泛的应用。

REPLI-g Single Cell Kit则是专为单细胞研究人员而设计的，可以均一地扩增低至单个细胞（1-1000个）或pg级的纯化后基因组DNA，覆盖基因组所有位点。与之前的试剂盒相比，它有两点不同之处：采用优化配方的高保真Phi 29 聚合酶；增加了UV去污染步骤。REPLI-g Single Cell Kit通过使用专门的缓冲液和试剂，反应设置相当简单，处理时间仅需15 分钟。这些独特的组分，再加上标准化的UV 处理步骤，能够消除任何残留DNA的污染，最大程度确保高质量结果仅仅来自您的样本。

在此基础上，QIAGEN新推出的QIAseq FX Single Cell DNA Library kit则为单细胞的文库制备提供了一个完整的无缝连接解决方案。这个试剂盒包含细胞裂解、全基因组扩增、DNA片段化以及PCR-free的NGS文库制备各个环节所需的全部试剂，整体流程从单细胞到文库构建完成仅需不到4小时。

与常规的单细胞NGS文库制备相比，试剂盒无需任何PCR扩增，极大降低了PCR bias及duplication，同时也最大程度减少了GC偏差，确保了文库的多样性高和基因组的全面覆盖。同时，高保真的MDA反应也引入较少的测序误差，显著降低了结果中的假阳性，从而实现了更加灵敏的突变检测。来自QIAGEN专利的特殊FX核酸片段化酶，不依赖于任何识别位点，通过单一酶的作用可对基因组DNA实现快速无偏差的均匀打断，更进一步的确保了测序结果的准确性。更低的背景干扰，更全面的覆盖，更简便快速的工作流程，无疑是分析单细胞或极微量样本中点突变或拷贝数变异等DNA变异的绝佳选择。（生物通 余亮）

欢迎索取QIAGEN REPLI-g single cell kit的详细资料

参考文献

Thoendel, M., Jeraldo, P., Greenwood-Quaintance, K. E., Yao, J., Chia, N., Hanssen, A. D., ... Patela, R. (2017). Impact of contaminating DNA in whole-genome amplification kits used for metagenomic shotgun sequencing for infection diagnosis. Journal of Clinical Microbiology, 55(6), 1789-1801. DOI: 10.1128/JCM.02402-16