Nature子刊：CRISPR技术发现表观遗传对染色体关键结构域的影响

来自西奈山伊坎医学院(ISMMS)的一组研究人员发表了题为“The methyltransferase SETDB1 regulates a large neuronspecific topological chromatin domain”的文章，通过细胞类型特异性3D基因组图谱，靶向表观基因组编辑（由赛业生物提供）等技术手段，识别出了一种能帮助基因组免受CTCF过度结合的SETDB1依赖性“盾牌”……

　　生物通报道：染色质的3D结构会随着细胞的生活周期而变化，对我们人体的健康和疾病发生产生重要的影响。近年来随着新技术的发展，科学家们发现染色质折叠让一些DNA片段彼此靠近并发生互作，他们将这样的区域称为拓扑相关结构域TAD。大脑中TAD结构与神经精神疾病的患病风险息息相关，但这一研究领域仍存在许多未解之谜。

来自西奈山伊坎医学院(ISMMS)的一组研究人员发表了题为“The methyltransferase SETDB1 regulates a large neuronspecific topological chromatin domain”的文章，通过细胞类型特异性3D基因组图谱，靶向表观基因组编辑（CRISPR载体构建技术由赛业生物提供）等技术手段，识别出了一种能帮助基因组免受CTCF过度结合的SETDB1依赖性“盾牌”，细胞如果丢失这个“盾牌”，就会出现位点特异性表观遗传漏洞，导致兆级规模的高阶染色质崩塌（chromatin collapse）。

CRISPR慢病毒载体系统包括两个载体：gRNA慢病毒载体与Cas9慢病毒载体。赛业生物的gRNA慢病毒载体使用了human U6 promoter转录gRNA。gRNA被Cas9识别，与基因组序列结合，从而引起Cas9对基因组序列的剪切。gRNA靶序列与目标基因DNA序列的匹配程度决定了gRNA的切割效率，而gRNA靶序列与其他目的基因DNA序列的匹配程度决定了gRNA的脱靶效应。赛业生物病毒包装技术手册与资料，点此获取

这一研究成果公布在Nature Genetics杂志上，由西奈山伊坎医学院精神病学家Schahram Akbarian领导完成。这位学者曾参与研究指出，在不同的大脑区域，甲基化的模式存在差异，这意味着表观遗传学因素参与了大脑功能的形成与划分。这些甲基化模式在不同种族、年龄或性别的人群中都得到了证明。

TADs是什么？

人类基因组包含大约20,000个蛋白质编码基因。令人惊讶的是，只有一毫米长的秀丽隐杆线虫（C. elegans），拥有几乎跟人类相同数量的基因，但却与人类的生物复杂性不同。这是因为人类能够更好地发挥其遗传潜力，首先通过修改基因产物，其次通过使用具有不同功能的相同基因。延伸阅读：PLOS：线虫发育时序的关键调节因子。

这需要高度的调控，因为身体的每个细胞都含有相同的遗传信息。科学家估计，人类基因组中大约有40%致力于基因调控。然而，目前尚不清楚它是如何确保“哪个调控因子影响——或不影响哪个基因”。TADs——拓扑相关结构域，在这方面发挥了关键作用：TAD是DNA片段，在其中DNA形成了包含组蛋白、调节蛋白和转录因子的大型三维结构。每个TAD包含一个或多个基因连同其所有的调控元件。它们的结构在进化上是保守的，可能存在于不同的细胞类型以及各种物种中。哺乳动物基因组在细胞核中形成了许多megabase级的拓扑相关结构域TAD。破坏TAD会影响长距离基因调控，引起致病性的表型。举例来说，破坏TAD结构的DNA删除、倒置或者重复能够导致人类肢体畸形。

研究表明，大脑中也存在TAD结构，并且神经精神疾病风险的全基因组关联研究表明TAD与大脑相关疾病存在一定的关联，但是具体的调控机制尚不清楚。

在这篇文章中，研究人员发现一组superTADs亚集的神经元维护需要SETDB1（也被称为ESET或KMT1E），这是一种组蛋白H3 Lys9甲基转移酶。研究表明Setdb1（Kmt1e）能广泛调控干细胞中的逆向元件抑制（retroelement suppression）和转录沉默。研究人员通过细胞类型特异性3D基因组图谱，靶向表观基因组编辑等技术手段，识别出了一种能帮助基因组免受CTCF过度结合的SETDB1依赖性“盾牌”，细胞如果丢失这个“盾牌”，就会窗户下独特的位点特异性表观遗传漏洞，导致兆级规模的高阶染色质崩塌（chromatin collapse）。

靶向表观基因组编辑

研究人员为了了解SETDB1的甲基化水平对CTCF结合位点的影响，通过靶向表观基因组编辑分析了cPcdh位点，他们采用的是一个叫做SunTag的技术。SunTag实质上是一套分子挂钩，其能够将多个拷贝的生物活性分子挂到可用来靶向一些基因或其他的分子的蛋白质支架上。相比于没有这些挂钩的组装分子，整合了SunTag的分子生物活性显着放大。

整合了SunTag的CRISPR分子可用于精确地控制基因组内大量基因的表达，研究人员利用这一技术发现SETDB1依赖的环结构可以绕过0.2-1 Mb线性基因组，并从TAD^cPcdh条纹辐射到cPcdh基因座内的顺式调控序列，抵消较短范围的启动子-增强子接触造成的影响。

研究表明SETDB1抑制复合物包含了多个KRAB锌指蛋白，能保护神经元基因组免受过量CTCF结合的影响，并且对于TAD^cPcdh的结构维持至关重要。

下一步，研究人员将分析神经元中Setdb1的过量表达，以及其它的cPcdh基因表达的调控蛋白的丢失是否会启动神经元中的TAD特异性3D基因组改变。

我们人体的每个染色体都有数以百计的TAD结构，分析“TAD通过TAD”，以及通过细胞类型特异性方式揭示脑细胞中高阶染色质的调控机制，是一项令人兴奋，且具有挑战性的任务。

（生物通：万纹）

原文标题：

The methyltransferase SETDB1 regulates a large neuronspecific topological chromatin domain. Received 3 February; accepted 5 June; published online 3 July 2017; doi:10.1038/ng.3906